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.2017年12月；10（12）：e004252。
doi:10.1161/CIRCHEARTFAILURE.117.004252。

肿瘤坏死因子心脏限制性过度表达小鼠左心室重构过程中蛋白质质量控制受损

贾斯汀·哈图佩 1, 加博尔·德·萨莱 1, 王伟（音译） 1, 马秀翠 1, 阿比纳夫·迪万 1, 道格拉斯·L·曼 2
附属公司

肿瘤坏死因子心脏限制性过度表达小鼠左心室重构过程中蛋白质质量控制受损

贾斯汀·哈图佩等。 圆形心脏衰竭. 2017年12月.

摘要

背景：心脏持续炎症足以引发左心室功能障碍和左心室重塑。虽然炎症与导致不利左心室重构的许多生物变化有关，但炎症与心脏蛋白质质量控制之间的关系尚不清楚。

方法和结果：为了研究慢性炎症与蛋白质质量控制之间的关系，我们使用了一种由心脏限制性过度表达TNF（肿瘤坏死因子；我的6-sTNF）。我的6-sTNF小鼠在与蛋白酶体功能障碍和自噬受损相关的心肌细胞内形成含有泛素标记蛋白的蛋白聚集体。尽管核心20S亚基功能正常，但26S蛋白酶体功能异常。我们发现自噬底物在我的6-sTNF小鼠，也可见于终末期心力衰竭患者的组织中。此外，有证据表明这些小鼠服用氯喹后自噬体清除受损，表明自噬流量受损。最后，雷帕霉素复合物1（mTORC1）激活的哺乳动物靶点增加，这与蛋白酶体和自噬的抑制有关。

结论： 我的6-持续炎症信号传导的sTNF小鼠出现蛋白酶体功能障碍和自噬流量受损，这与mTORC1激活增强有关。

关键词：自噬；炎症；心肌炎；肿瘤坏死因子；泛素。

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数字

图1
图1
泛素蛋白结合物我的6-sTNF小鼠心脏。A） 心肌提取物中泛素蛋白结合物的Western blot分析我的6-sTNF和WT同窝小鼠在12周龄时进行对照。B） 总结心肌提取物中泛素化蛋白结合物水平的分组数据我的6-sTNF和同窝小鼠在4周、8周和12周龄时进行对照（每组5只）**P（P）通过双向方差分析（带Bonferoni校正）得出<0.001。C） 含有泛素标记底物和p62的蛋白质聚集体的积累我的6-sTNF心脏。WT和WT左室心肌的代表性免疫荧光图像我的6-sTNF小鼠的泛素、p62和心肌细胞特异性中间丝结蛋白染色（每组5只）。20倍物镜，2.5倍放大最右侧的合并图像。
图2
图2
蛋白酶体功能我的6-sTNF心脏。A） 在4周龄、8周龄和12周龄时评估26S蛋白酶体的糜蛋白酶样活性我的6-sTNF和室友通过在ATP存在下分解荧光底物Suc-LLVY-AMC来控制小鼠。组数据的结果显示为与窝友控制活动的比率。B） 在4周龄、8周龄和12周龄时评估26S蛋白酶体的糜蛋白酶样活性我的6-sTNF和室友对照小鼠（N=5）通过在不含ATP的情况下裂解荧光底物Suc-LLVY-AMC。组数据的结果显示为与同窝对照活动的比率**P（P）<0.001，且NS=不显著。C） 来自3个19S蛋白亚基独立实验的代表性Western blot分析。箭头表示完整和劈开的亚单位。D） 20S蛋白酶体核心亚基和单个催化亚基的代表性蛋白质印迹分析。
图3
图3
自噬底物的积累我的6-sTNF心脏。A） 12周龄WT心肌提取物中LC3和p62水平的代表性Western blot（左）和定量数据（右）我的6-sTNF小鼠。对于定量分析，每组从两个独立实验中获得的总n=7。B） mRNA编码LC3的定量RT-PCR(地图1lc3a）和第62页(平方米1）.N=每组7个*P（P）<0.05和**P（P）<0.001.
图4
图4
自噬通量受损我的6-sTNF小鼠。12周大的WT室友和我的6-sTNF小鼠在处死前4小时用溶媒（veh）或氯喹（CQ）（40 mg/kg IP注射液）治疗。A） LC3-II水平的代表性Western blot。B） 定量数据包括来自多个独立实验的N=6的总数*P（P）<0.05，NS=不显著。
图5
图5
自噬受损的机制。所有测量均在12周大的WT和我的6-sTNF小鼠。定量分析包括每组7只小鼠。A）指示灯1和灯2用定量RT-PCR测定mRNA水平。B） LAMP1和LAMP2水平的代表性Western blot（左）和定量分析（右）。C） 组织蛋白酶B（左）和D（右）在WT和我的6-sTNF小鼠。D） 代表性Western blot（左）和定量分析（右）测量磷酸化和总4E-BP1和p70S6K。定量数据显示为相对于WT的磷酸化总量*P（P）<0.05, **P（P）<0.001，且NS=不显著。
图6
图6
终末期扩张型心肌病（DCM）患者样本中自噬底物的积累。A） 共9个DCM样本的代表性免疫荧光图像显示存在含有泛素化蛋白和p62的蛋白聚集体（20×客观）。B） 非失败对照组和NICM患者样本中LC3和p62水平的定量Western blot分析。N=8表示无故障，N=10表示DCM*P（P）<0.05.
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