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比较研究
.2018年1月；38(1):232-244.
doi:10.1161/ATVBAHA.117.309853。 Epub 2017年11月30日。

转导ETV2的外膜Sca1+细胞参与内皮命运并改善损伤后的血管重塑

亚历山大·勒布拉斯 1, Baoqi余 1, Shirin Issa Bhaloo公司 1, 薛冲红 1, 张忠义 1, 胡燕华 1, 徐庆波 2
附属公司
比较研究

转导ETV2的外膜Sca1+细胞参与内皮命运并改善损伤后的血管重塑

亚历山大·勒布拉斯等。 动脉硬化血栓血管生物. 2018年1月.

摘要

目标：血管外膜Sca1+（干细胞抗原-1）前体细胞优先分化为平滑肌细胞，这有助于血管移植中的血管重塑和新生内膜的形成。因此，指导Sca1的分化+向内皮细胞系分化的细胞可能代表了一种新的治疗血管疾病的策略。

方法和结果：因此，我们开发了一种基于ETV2（ETS变体2）单基因转移的快速、可重复的方法来区分Sca1+在内皮损伤模型中，研究了细胞转化对血管增生的影响。ETV2转导后，Sca1+外膜细胞的早期内皮细胞基因表达显著增加，包括VE-卡德林,Flk-1型、和第2级在mRNA和蛋白质水平。ETV2过表达还通过表观遗传调控，通过降低DNA修饰酶十级易位加氧酶的表达，诱导一组平滑肌细胞和间充质基因的下调。外膜Sca1+与未移植细胞的对照动脉相比，线损伤股动脉外膜侧移植的细胞增加了血管壁的增生。相反，与对照相比，接种ETV2转导细胞的动脉显示增生减少。

结论：这些数据证明，血管祖细胞的基因操作是改善内皮损伤后血管功能的一种有希望的方法。

关键词：外膜；细胞分化；干细胞；血管疾病；血管重塑。

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数字

图1。
图1。
外膜Sca1+（AdvSca1）祖细胞分化为平滑肌细胞/间充质细胞，并在体外和体外对血管损伤进行表观遗传学改变。A类在含有胎牛血清（FBS）+LIF（白血病抑制因子）或血清置换（SR）的培养基中培养3d的AdvSca1细胞的形态学。B类，在含有αSMA（α-平滑肌肌动蛋白；红色）的FBS或SR培养基中培养5d的AdvSca1细胞的免疫荧光染色。DAPI（4'，6-二氨基-2-苯基吲哚）染色细胞核（蓝色）。定量实时聚合酶链反应(C类)acta2、Pdgfrβ、cdh11、col1a、cd34和(天)在不同条件下培养的AdvSca1细胞中TET（十级易位）的表达（实验分三次进行*P（P）<0.05, **P（P）<0.01***P（P）<0.001, ****P（P）<0.001; 代表2个独立实验的数据）。E类使用从培养在FBS+LIF或SR中的AdvSca1细胞中分离的基因组DNA（n=3个独立实验）进行5hmc全局富集的斑点杂交。使用ImageJ软件进行密度测定量化。小鼠AdvSca1细胞在条件培养基（CM）存在下培养5天，条件培养基取自同一大鼠动脉的未损伤或损伤部分。F类、AdvSca1细胞的αSMA免疫荧光染色（红色）和αSMA增加+细胞（n=6支动脉*P（P）<0.05 vs未受损的主动脉-CM；每个实验计算5×20个放大视野）。G公司，AdvSca1细胞免疫荧光染色5hmc（绿色）。每核和每×40倍视野的荧光强度，n=4倍视野***P（P）<0.001 vs未损伤的主动脉-CM。直方图代表了4种不同动脉的结果。
图2。
图2。
腺病毒介导的ETV2（ETS变体2）过度表达促进外膜Sca1的内皮分化+（AdvSca1）细胞。A类，ETV2的分化方案和免疫荧光染色示意图（红色）。B类、AdvSca1的形态、外膜Sca1+在血清置换（SR）中分化的细胞，并用零病毒（Adv-null）和外膜Sca1转导+细胞在SR中分化，并在第7天用ETV2病毒（Adv-ETV2）细胞转导。C类，摄取乙酰化LDL（低密度脂蛋白；红色荧光）的能力。天，基于微阵列结果，所选基因的热图显示了Adv-ETV2细胞中内皮细胞（EC）基因的富集表达。颜色条表示基因在刻度中的表达。E类，微阵列后全球基因表达的层次聚类。以出生后小鼠平滑肌细胞、小鼠EC系CRL2581（YS-EC）和MS1（EC）为对照。定量实时聚合酶链反应(F类)EC受体cdh5、tie2、Flk-1和Flt1、转录因子Fli和(G公司)EC特异基因英语7,拉西普1、和机器人4在胎牛血清（FBS）+LIF（白血病抑制因子）或SR+VEGF中培养的Adv-ETV2、Adv-null细胞和AdvSca1细胞中(*P（P）<0.05, **P（P）<0.01***P（P）<0.001, ****P（P）<0.0001; n=4个独立实验）。H（H）、Adv-null和Adv-ETV2细胞的VEGFR2（绿色）和ETV2（红色）免疫荧光染色。
图3。
图3。
外膜Sca1中ETV2（ETS变体2）过度表达+（AdvSca1）细胞促进血管生成。A类，LV H2b-RFP（红色荧光蛋白）稳定转导的AdvSca1，外膜Sca1+在血清置换（SR）中分化的细胞并用零病毒（Adv-null）或外膜Sca1转导+在SR中分化并用ETV2病毒（Adv-ETV2）细胞转导的细胞用于体内基质凝胶塞试验。与其他两组相比，Adv-ETV2细胞形成了更密集的毛细血管样结构网络（黑色箭头）(*P（P）<0.05; 每个塞子计数5个显微镜视野；n=每个群体5个插头）。免疫荧光染色后，RFP Adv-ETV2在新形成的毛细血管中表达VE-cadherin（绿色）。B类、代表性亮场图片和用培养有ETV2过表达腺病毒的ApoE Sca1-GFP（绿色荧光蛋白）小鼠主动脉环外植体观察到的血管萌芽的量化，与对照无腺病毒进行比较（3个独立动脉/实验中每组18个环*P（P）<0.05).C类、GFP量化+cd31+细胞（n=来自2条独立动脉的5个环/实验*P（P）<0.05).天，Sca1-GFP转基因小鼠主动脉环外植体的代表性图片，用ETV2过表达腺病毒培养后染色cd31（红色）。箭头表示cd31-阳性GFP细胞。
图4。
图4。
ETV2（ETS变体2）过度表达抑制外膜Sca1的分化+（AdvSca1）细胞转化为平滑肌细胞/间充质细胞。A类，所选基因的热图显示间充质和促纤维化基因在外膜Sca1中的富集表达+与外膜Sca1相比，在血清置换（SR）中分化的细胞和用无病毒（Adv-null）细胞转导的细胞+细胞在SR中分化并用ETV2病毒（Adv-ETV2）转导，来自基于微阵列的两个单独实验。颜色条表示基因在刻度中的表达。B类通过定量实时聚合酶链反应验证在胎牛血清（FBS）+LIF（白血病抑制因子）或SR+VEGF中培养的Adv-ETV2、Adv-null细胞和AdvSca1中指示基因的mRNA变化（n=4个独立实验*P（P）<0.05, **P（P）<0.01***P（P）<0.001, ****P（P）<0.0001).C类，AdvSca1、Adv-null和Adv-ETV2细胞对αSMA（α-平滑肌肌动蛋白）和胶原的免疫荧光染色1。天Western blot分析AdvSca1、Adv-null和Adv-ETV2细胞中VE-cadherin、Pdgfrβ和αSMA的表达。GAPDH抗体用于负荷控制。采用小鼠内皮细胞MS1（1）和CRL2581（2）的蛋白提取物作为内皮细胞（EC）蛋白谱表达的阳性对照。E类，通过流式细胞术定量cd34+Sca1型+，cd34+Pdgfrβ+和cd34+第2级+未分化AdvSca1、Advv-null和Advv-ETV2细胞中的种群(*P（P）<0.05, ***P（P）<0.001; n=4–5个独立实验）。
图5。
图5。
鉴定与外膜Sca1分化相关的IGFBP（胰岛素样生长因子结合蛋白）-5–TET（十水平易位）通路+（AdvSca1）细胞转化为平滑肌细胞（SMCs）/间充质细胞。A类、胎牛血清（FBS）+白血病抑制因子（LIF）、血清置换（SR）+血管内皮生长因子（VEGF）、外膜Sca1中培养的AdvSca1细胞中tet1、tet2和tet3 mRNA表达的定量实时聚合酶链反应（RT-PCR）+细胞在SR中分化，并用空病毒（Adv-null）和外膜Sca1转导+细胞在SR中分化，并用ETV2（ETS变异体2）病毒（Adv-ETV2）细胞转导（n=3个独立实验*P（P）<0.05, **P（P）<0.01).B类TET3的AdvSca1、Advv-null和Advv-ETV2细胞的免疫荧光染色（红色）。DAPI（4'，6-二氨基-2-苯基吲哚）染色细胞核（蓝色）。定量RT-PCR(C类)tet和(天)SMC基因行为2,pdgfrβ、和列1a转染ctrl siRNA或siRNA，3天后在FBS或SR中表达AdvSca1细胞测试1,测试2、和测试3（一式三份*P（P）<0.05, **P（P）<0.01***P（P）<0.001, ****P（P）<0.0001; 代表2个独立实验的数据）。E类，IGFBP-5 mRNA在Adv-null和Adv-ETV2细胞中的表达。定量RT-PCR(F类)IGFBP-5型, (G公司)SMC基因行为2,pdgfrβ,cdh11型、和列1a、和(H（H）)转染ctrl siRNA或siRNA IGFBP-5的FBS或SR中3d后AdvSca1细胞中TET基因的表达（一式三份*P（P）<0.05, **P（P）<0.01***P（P）<0.001, ****P（P）<0.0001; 代表2个独立实验的数据）。
图6。
图6。
外膜Sca1+血清置换（SR）中分化的细胞和ETV2（ETS变异体2）病毒（Adv-ETV2）细胞转导的细胞可改善动脉损伤模型中的血管重塑。A类，LV H2b-RFP（红色荧光蛋白）稳定转导的外膜Sca1+（AdvSca1），外膜Sca1+细胞在SR中分化并用空病毒（Adv-null）转导，Adv-ETV2细胞接种在线损伤股动脉的外膜侧。损伤后一周，各组外膜均可见RFP细胞。在移植AdvSca1细胞的动脉内膜中也可以看到RFP细胞。（A，外膜；N，内膜）。B类苏木精和伊红的代表性图像(顶部)和弹性蛋白(底部)各组伤后2周在组织学切片上进行染色：无细胞动脉，接种有AdvSca1细胞、Adv-null或Adv-ETV2细胞。箭头表示内膜、中膜和外膜的外部界限。C类在每根损伤动脉的3个断面上测量外膜、中膜和新生内膜，并计算内膜/中膜和外膜/中膜比值（每组6条动脉*P（P）<0.05, **P（P）<0.01). 还显示了未受损动脉的外膜、中层和外膜/中层比率的测量结果（每个动脉分析3个断面；n=4条动脉）。
图7。
图7。
外膜Sca1+在血清置换（SR）中分化的细胞和用ETV2（ETS变异体2）病毒（Adv-ETV2）细胞转导的细胞在体内外诱导较少的平滑肌细胞（SMC）增殖，并促进损伤动脉的再分化。A类，在损伤后2周的动脉切片上使用PCNA（增殖细胞核抗原）抗体进行免疫组化的典型图片，其中无细胞、外膜Sca1+在SR中分化并用空病毒（Adv-null）转导的细胞，或接种Adv-ETV2细胞（n=4条动脉）。箭头表示内膜和中层的外部界限。PCNA公司+对每个实验组的培养基细胞进行量化(**P（P）<0.01; n=4）。B类，SMC在未分化外膜Sca1顶部的Transwell上培养+、Adv-null或Adv-ETV2细胞培养3天。SMC与Edu孵育2小时，收获、固定并使用Fx循环分析细胞周期分布(*P（P）<0.05, **P（P）<0.01 ***P（P）<0.001; n=3；代表2个独立实验的数据）。C类用损伤后1周的动脉石蜡切片的cd31抗体进行免疫染色，其中未接种细胞、Adv-null或Adv-ETV2细胞。
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