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.2017年11月30日；8(1):1871.
doi:10.1038/s41467-017-02050-w。

NDP52激活核肌球蛋白VI增强RNA聚合酶II转录

娜塔莉亚·菲利 1, 尤克蒂·哈里·古普塔 1, 阿尔利亚·多斯·桑托斯 1, 亚历山大·库克 1, 西蒙波兰 2, 西蒙·阿梅尔贝格 2, 梅迪·帕森斯 2, 克里斯托弗·托斯兰德 三
附属公司

NDP52激活核肌球蛋白VI增强RNA聚合酶II转录

娜塔莉亚·菲利等。 国家公社. .

摘要

已发现肌球蛋白VI（MVI）在卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌中过度表达。此外，它还被证明在调节细胞增殖和迁移以及与RNA聚合酶II（RNAPII）相互作用中发挥作用。在这里，我们发现MVI的反向折叠调节其结合DNA的能力，并且假定的转录辅激活物NDP52可以解除MVI的自动抑制，从而使DNA结合。此外，我们发现MVI-NDP52复合物与RNAPII结合，RNAPII对转录至关重要，而NDP52或MVI的缺失会降低稳态mRNA水平。最后，我们证明MVI直接与核受体相互作用以驱动靶基因的表达，从而表明与细胞增殖和迁移有关。总的来说，我们认为MVI可能作为一种辅助马达来驱动转录。

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利益冲突声明

作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1
图1
肌球蛋白VI分布于整个细胞核。一MVI领域的卡通描述和文本中讨论的关键特征。b条针对HeLa细胞和分离细胞核中MVI（洋红色）和DNA（青色）的免疫荧光染色（细胞核图像见补充图1）。箭头突出显示细胞核内的丝状结构。在细胞核中点采集图像。比例尺10 μm用于整个图像和1 μm（插入件）。c（c）HeLa细胞分离后针对MVI的Western blot。管蛋白和层粘连蛋白B分别用作细胞质和核标记物。d日HeLa细胞中瞬时表达NI-和LI-GFP-MVI的代表性图像，结合DNA染色（青色）（补充图3）。如B所示采集的图像。e（电子）使用500 bp DNA底物。如果归一化为输入样本的波段强度图（5 μM）。误差条代表三种独立制剂的SEM。(**第页 < 0.001（双尾）t吨-DNA存在与缺失之间的测试）
图2
图2
肌球蛋白VI与DNA的结合。一,b条MVI结构域相对于40的荧光各向异性滴定 bp荧光素酰胺（FAM）-DNA（50 nM）。按照方法中的描述进行数据拟合(K（K） d日 ± 扫描电镜n个 = 3个独立实验）。由于结合亲和力低，Motor1-814无法使用该模型进行安装。c（c）描述中央商务区二级结构的卡通。结合伙伴基序和已知的脂质结合位点以及三个预测的DNA结合簇被强调。黑线代表预计参与DNA结合的残基。序列比对显示了位点B和C的保守性。d日的结构C类CBD，带有站点B（红色）、C（蓝色）和WWY图案（绿色）（PDB:2KIA）。e（电子）,如果CBD构建体的荧光各向异性滴定，在一
图3
图3
肌球蛋白VI折叠的调节。一FRET滴定N个MVI公司TAIL（尾部）对抗CBD（1 μM）或CBD（W1221A），在存在DNA或NDP52的情况下，在10 微米。按照方法中的描述进行数据拟合。由于低信号变化，NDP52和CBD（W1221A）数据绘制为断开点。原始强度数据参见补充图4a–c。b条2的代表性荧光光谱 微米GFP-MVITAIL（尾部）-招标书 ± 15 μM NDP52。c（c）体内MVI构象动力学的FLIM测量。上图是显示构件的示意图。左侧是GFP强度和寿命图像。对，生物传感器的强度和寿命图像。生命周期(τ)用假彩色标尺表示。比例尺为20 微米。d日被His-tagged拖垮的CBDN个MVI公司TAIL（尾部）都在10点 微米 ± 20 微米40 bp DNA。P和S代表颗粒和上清液部分。e（电子）MVI结构域对40的荧光各向异性滴定 bp FAM DNA，如图2a所示
图4
图4
NDP52是核肌球蛋白VI结合伙伴。一卡通和结构模型描绘了文中提到的NDP52域。b条对HeLa细胞和分离细胞核中的NDP52（绿色）和DNA（青色）进行免疫荧光染色，如图1b所示。箭头突出显示丝状结构。比例尺10 μm用于整个图像和1 插入件为μm。c（c）HeLa细胞分离后针对NDP52的Western blot。微管蛋白和层粘连蛋白B分别用作细胞质和核标记物。d日MVI的FRET滴定TAIL（尾部）构建NDP52（1 μM）。按照给出K（K） d日如图所示e（电子）（误差条代表三个独立实验的SEM）。如果MVI从核提取物中分离出NDP52的Western blotTAIL（尾部）构造。重组蛋白的装载控制如补充图9所示。克对NDP52（绿色）、MVI（洋红色）和DNA（青色）进行免疫荧光染色，如图1b所示。插页描述了共同定位病灶。比例尺10 μm用于整个图像和1 插入件为μm。示出了HeLa和原子核的皮尔逊系数（补充图5b）。误差条代表10幅图像的SEM
图5
图5
NDP52依赖性肌球蛋白VI二聚体。一FITC-MVI的FRET滴定TAIL（尾部）对1 微米AF555-MVI尾部 ± DNA（20 μM）和NDP52（20 μM）。按照给出K（K） d日如图所示b条有关原始强度数据，请参见补充图7a–c。b条的绘图K（K） d日来自滴定一和补充图7d–g（误差条代表三个独立实验的SEM）。c（c）MVI单独固定（蓝色）、抗体（红色）和NDP52（绿色）的滑丝试验的速度直方图。插入显示第一帧（红色）和60之后 s（绿色）。d日两种不同化学计量比的NDP52依赖性二聚化途径。（i） NDP52展开MVI，然后直接招募第二个分子。（ii）每个MVI由单个NDP52展开
图6
图6
NDP52转录调控。一对NDP52（绿色）、RNAPII（品红色）和DNA（青色）进行免疫荧光染色，如图1b所示。插入描述了共同定位焦点。比例尺10 μm用于整个图像和1 插入件为μm。b条HeLa细胞核上的免疫荧光，如（a）中的Pearson系数（误差条表示10张图像的SEM）。c（c）联合免疫沉淀NDP52和RNAPII，使用NDP52抗体免疫沉淀HeLa细胞的RNAPII。在受到NDP52的siRNA敲除的HeLa细胞中不发生免疫沉淀。d日通过NDP52结构体和CoCoA从核提取物中分离出RNAPII的Western blot。重组蛋白的装载控制如补充图9所示。e（电子）His-tagged拉下CoCoAN个MVI公司TAIL（尾部）都在5点 微米。P和S代表颗粒和上清液部分。如果方法中描述的抗体耗竭后HelaSubscribe提取物的体外转录。将样品归一化为非耗尽的对照反应（误差条代表SEM**第页 < 0.001（双尾）t吨-测试）（补充图8a，b）
图7
图7
将肌球蛋白VI偶联到RNAPII复合物。一HelaSubscribe提取物在25 μM，除非另有说明。站点B和C是指C类中央商务区Δ场地B和C类中央商务区Δ场地C分别是。TIP是指在25 μM的MVI抑制剂（TIP）。将样品归一化为图6f中的对照样品（误差条代表五个独立实验的SEM**第页 < 0.001（双尾）t吨-测试）。控制实验见图8c。b条利用重组MVI（1 μM），NDP52（5 μM）和F-actin（5 μM），如方法所述（误差条代表五个独立实验的SEM**第页 < 0.001（双尾）t吨-测试）。c（c）共免疫沉淀MVI和RNAPII，使用MVI抗体免疫沉淀HeLa细胞中的RNAPII。受到MVI siRNA敲低的HeLa细胞中不发生免疫沉淀。d日通过MVI构建物从核提取物中分离出抗RNAPII的蛋白质印迹。重组蛋白的装载控制如补充图9所示。e（电子）转录延伸中MVI的工作模式。MVI在C端与伴侣和/或DNA结合，在N端通过肌动蛋白与RNAPII结合
图8
图8
肌球蛋白VI与雌激素信号有关。一下拉2 10μM中央商务区 μM GST-ER.P和S代表颗粒和上清液部分。b条小干扰RNA敲低MCF-7细胞MVI后ER基因靶点的表达。表达式绘制为模拟单元格中表达式的百分比。急诊室(ESR1系列)β-actin被用来反映转录的全局变化。c（c）MCF-7细胞中ERE启动子驱动的荧光素酶报告分析。雌二醇使启动子活性增加了5倍。siRNA敲除MVI导致活性降低3倍。乙醇被用作实验的载体控制（误差条代表三个独立实验的SEM**第页 < 0.001（双尾）t吨-测试）。d日ER招募MVI的工作模式。MVI与ER结合，然后被NDP52（或CoCoA）激活，从而通过肌动蛋白与RNAPII结合。与NDP52或CoCoA的关联将MVI与一般转录共激活物联系起来，以启动RNAPII的招募
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