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.2017年11月29日；7(1):16556.
doi:10.1038/s41598-017-16448-5。

抗磷脂抗体增加胎盘细胞外囊泡线粒体DNA水平：子痫前期警报

曼西·唐 1, 卡罗琳·约翰逊 2 三, 凤仪晓 2 4, 彼得·斯通 2, 乔安娜·L·詹姆斯 2, 齐晨 2, 林西·M·克里 2, 劳伦斯·查姆利 2
附属公司

抗磷脂抗体增加胎盘细胞外小泡中线粒体DNA水平：先兆子痫的警报

曼西·唐等。 科学代表. .

摘要

子痫前期的发病机制尚不清楚，但已知胎盘因素在导致母亲内皮细胞功能障碍中起着关键作用。一个潜在因素是胎盘微泡和纳米泡。抗磷脂抗体（aPL）会使先兆子痫的风险增加十倍，部分原因是破坏了合胞体滋养层细胞中的线粒体。由于线粒体DNA（mtDNA）是一种可能激活内皮细胞的危险相关分子模式（DAMP/alarmin），因此当前研究的目的是研究aPL是否影响胎盘囊泡的挤出数量、其mtDNA含量以及其激活内皮细胞能力。孕早期人类胎盘移植体暴露于aPL后，挤压出的微泡和纳米泡的数量和大小均不受影响（n=5），但其mtDNA水平增加（n=6）。这些小泡显著激活了内皮细胞（n=5），这是通过阻断细胞外DNA受体toll-like receptor 9（TLR-9）来阻止的。因此，aPL可能通过增加与胎盘囊泡相关的线粒体DNA的数量而增加先兆子痫的风险。线粒体DNA被TLR-9识别为DAMP，导致内皮细胞活化，这增加了胎盘囊泡或TLR-9可能成为药物干预的靶点，以减少妊娠期aPL的后果的可能性。

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作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
在存在aPL的情况下，妊娠早期人类胎盘产生微泡和纳米泡。妊娠早期人类胎盘用胎盘培养基（未处理）培养，或在同种型匹配对照抗体（IgG）或鼠aPL抗体（ID2，50 µg/mL，n = 10个胎盘，A类——F类). 在一些实验中，在aPL阳性患者（aPL，50 µg/mL，n = 5胎盘），非自身免疫个体的总IgG用作对照（IgG，G公司——L（左），个 = 5胎盘）。微型-(A类——C类,G公司——我)和纳米(D类——F类,J型——L（左）)收集囊泡，通过纳米粒子追踪分析其浓度、平均值和模态尺寸。通过重复测量单向方差分析和Bonferroni校正（*p<0.05).
图2
图2
与来自ID2处理胎盘的EV共培养后，HMEC-1细胞的表面ICAM-1表达水平和单核细胞粘附。从妊娠早期的人胎盘中收集宏、微、纳米囊泡，这些胎盘与ID2抗体或同型对照IgG（50 µg/mL，n = 5胎盘）。将EV的每一部分添加到融合的HMEC-1细胞单层中24 小时和内皮细胞活化通过基于细胞的ICAM-1表达的ELISA定量(A类)或使用单核细胞粘附试验(B). 通过Mann-Whitney检验评估统计差异（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****磅<0.0001，平均值 ± SEM）。
图3
图3
胎盘微泡和纳米泡中线粒体和核蛋白的典型蛋白质印迹。从妊娠早期人类胎盘的微泡和纳米泡中提取总蛋白，并通过western blotting（n = 6胎盘）。胎盘裂解物作为阳性对照。
图4
图4
核和线粒体DNA PCR扩增物的代表性凝胶电泳图像。从妊娠早期人类胎盘（n）的微泡和纳米泡中提取总DNA = 5胎盘）。对细胞核β2-微球蛋白和线粒体ND1进行标准PCR，产物在2.5%琼脂糖凝胶上可见(A类). 对线粒体基因组的完整保守序列进行长范围PCR，并在0.7%琼脂糖凝胶上对所得扩增产物进行可视化(B). 检测到的主要扩增子为15.1 kb，此外还有几个较小的mtDNA片段（箭头）扩增物。1：孕早期胎盘，2：无模板对照，3：微泡，4：纳米泡。
图5
图5
ID2处理胎盘微泡和纳米泡中线粒体和核DNA的水平。从孕早期人类胎盘的微泡和纳米泡中提取总DNA，这些微泡在没有抗体（UT）的情况下培养，或在存在同种匹配的对照IgG（IgG）或ID2抗体（50 µg/mL，n = 6胎盘）。使用针对ND1和RNase P的探针进行定量数字PCR。mtDNA的绝对拷贝数(A类)和核DNA(B)在一纳克的总DNA中进行了描述。由于数据是正态分布的，因此在各治疗组之间进行了重复测量单向方差分析，以测试统计差异（*p<0.05，**p<0.01).
图6
图6
胎盘EV与HMEC-1细胞TLR-9之间的相互作用。荧光共聚焦显微镜光学切片显示HMEC-1细胞(A类)用CellTracker培养的TM（TM）绿色CMFDA标记的胎盘微-(B)或纳米-(C类)小泡（绿色）。HMEC-1细胞的溶酶体用LysoTracker®Red DND-99（红色）标记，HMEC-1细胞核用Hoechst（蓝色）复染。箭头显示胎盘EV和溶酶体之间的共定位区域。比例尺 = 10 微米。将从ID2处理的胎盘中收集的微泡和纳米泡添加到HMEC-1细胞中，添加或不添加TLR-9拮抗剂（1 µM，antag，n = 6胎盘）。作为阳性对照，HMEC-1细胞用TLR-9激动剂（5 微米）。用基于细胞的ELISA测定表面ICAM-1的表达，并将其归一化为未经处理的HMEC-1细胞(D类). 通过Wilcoxin配对签名排序检验评估统计学差异（**p<0.01，***p<0.001，****磅<0.0001).
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