Mitochondrial dynamics controls anti-tumour innate immunity by regulating CHIP-IRF1 axis stability

doi:10.1038/s41467-017-01919-0

.2017年11月27日；8(1):1805.

doi:10.1038/s41467-017-01919-0。

线粒体动力学通过调节CHIP-IRF1轴稳定性控制抗肿瘤天然免疫

高正军¹, 李一元¹, 王飞（音译）¹, 陶晃¹, 科奇凡¹, 于章², 姜堰钟¹, 钱曹², 童超¹, 贾俊玲¹, 朔阳^3 4, 张龙（Long Zhang）¹, 宜川肖⁵, 周继勇⁶, 新华丰¹, 金进^7 8

附属公司

¹浙江大学生命科学研究所，杭州，310058，中国。
²浙江大学医学院邵逸夫爵士医院，杭州，310016。
³南京医科大学免疫学系，中国江苏省南京市，211166。
⁴南京医科大学生殖医学国家重点实验室，南京，211166，江苏省。
⁵中国科学院上海生命科学研究院健康科学研究所/上海交通大学医学院，上海，200031，中国。
⁶浙江大学农业部动物病毒学重点实验室，杭州，310058。
⁷浙江大学生命科学研究所，杭州，310058，中国。jjin4@zju.edu.cn。
⁸浙江大学农业部动物病毒学重点实验室，杭州，310058。jjin4@zju.edu.cn。

PMID： 29180626
预防性维修识别码：项目经理5703766
内政部： 10.1038/s41467-017-01919-0

线粒体动力学通过调节CHIP-IRF1轴稳定性控制抗肿瘤天然免疫

高正军等。国家公社. 2017.

.2017年11月27日；8(1):1805.

doi:10.1038/s41467-017-01919-0。

作者

高正军¹, 李一元¹, 王飞（音译）¹, 陶晃¹, 范可琪¹, 于章², 姜堰钟¹, 钱曹², 童超¹, 贾俊玲¹, 朔阳^3 4, 张龙（Long Zhang）¹, 宜川肖⁵, 周继勇⁶, 新华丰¹, 金进^7 8

附属公司

¹浙江大学生命科学研究所，杭州，310058，中国。
²浙江大学医学院邵逸夫爵士医院，杭州，310016，中国。
³南京医科大学免疫学系，中国江苏省南京市，211166。
⁴南京医科大学生殖医学国家重点实验室，南京，211166，江苏省。
⁵中国科学院上海生命科学研究院健康科学研究所/上海交通大学医学院，上海，200031，中国。
⁶浙江大学农业部动物病毒学重点实验室，杭州，310058。
⁷浙江大学生命科学研究所，杭州，310058，中国。jjin4@zju.edu.cn。
⁸浙江大学农业部动物病毒学重点实验室，杭州，310058。jjin4@zju.edu.cn。

PMID： 29180626
预防性维修识别码：项目经理5703766
内政部： 10.1038/s41467-017-01919-0

摘要

巨噬细胞、树突状细胞和其他固有免疫细胞参与炎症和宿主抵抗感染。线粒体动力学的代谢变化可能与Toll样受体激动剂介导的炎症反应和免疫细胞极化有关。然而，髓系免疫细胞线粒体形态是否影响抗肿瘤免疫尚不清楚。在这里，我们表明FAM73b，一种线粒体外膜蛋白，在Toll样受体调节的线粒体形态从融合到分裂的转变中具有关键功能。通过消融Fam73b（也称为Miga2）转换为线粒体裂变可促进IL-12的产生。在肿瘤相关巨噬细胞中，这种转换导致T细胞激活并增强抗肿瘤免疫。我们还发现线粒体形态影响Parkin的表达及其向线粒体的募集。Parkin通过蛋白水解控制下游CHIP-IRF1轴的稳定性。我们的发现确定了与线粒体动力学相关的机制，这些机制控制抗肿瘤免疫反应，并且是癌症免疫治疗的潜在靶点。

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利益冲突声明

作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1
FAM73b控制线粒体形态。用LPS（500 ng/ml）。使用MitoSpyTM Orange CMTMRos染色观察线粒体。显示线粒体形态的典型共焦图像，并使用Image-Pro进行量化分析，以条形图表示(一). 数据显示为平均值 ± 三个独立实验的SEM，每个重复计算100个细胞；颜色表示线粒体形态（长或短）。b条用EM（比例尺，1）分析WT BMDM的线粒体形态微米）。**c（c）**经LPS（500）处理的WT BMDM的时间推移图像 ng/ml）并用MitoSpyTM Orange CMTMRos染色。d日,**e（电子）**使用LPS刺激的WT小鼠BMDM对指示基因进行qRT-PCR和IB分析。**（f）**IFN-γ（10）刺激WT BMDM的典型共焦图像和条形图 ng/ml），适用于12 小时(克,小时)IL-4刺激的WT BMDM（20 ng/ml），适用于12 h.代表共焦(克)和EM(小时)给出了图像。我用qRT-PCR检测所示基因。所有qRT-PCR数据均以相对于*Actb公司*mRNA水平。所有数据都是三个独立实验的代表。比例尺英寸一,**c（c）**,**（f）**和克是5个微米；1英寸b条是1 微米；1英寸小时是2 微米。误差线为平均值 ± SEM值。双尾未配对t吨-进行了测试**P（P）* < 0.05; ***P（P）* < 0.01

图2
FAM73b缺陷小鼠对肿瘤生长具有抵抗力。一WT和FAM73b KO BMDM线粒体形态的电子显微镜观察。b条,**c（c）**FAM73b KO BMDM线粒体形态的典型共焦图像和统计分析(b条)或MFN1/2 KO MEF(**c（c）**). WT或FAM73b KO（KO）小鼠(n个 = 14）注射了2个 × 10⁵B16黑色素瘤细胞。肿瘤生长曲线(d日)和生存曲线(**e（电子）**). ELISA测定先天性(**（f）**)和自适应(克)第15天血清免疫。小时干扰素γ的ICS和流式细胞术分析⁺CD4细胞⁺和CD8⁺如上所述的T细胞，以代表图（左面板）和总结图（右面板）的形式呈现。百分比基于CD4总量⁺或CD8⁺T细胞。我,j个WT或FAM73b KO小鼠(n个 = 10）注射了800 μg MCA。无瘤小鼠的频率(我). 通过ELISA检测WT或FAM73b KO小鼠血清中的指示细胞因子。注射MCA后第150天从小鼠中收集血清(j个). 所有数据都是三个独立实验的代表。比例尺输入一是2 微米；中的那些b条和**c（c）**是5个微米。误差线为平均值 ± SEM值。双尾未配对t吨-进行了测试**P（P）* < 0.05; ***P（P）* < 0.01

图3
FAM73b调节髓系细胞的抗肿瘤反应。一,b条T细胞特异性KO小鼠的肿瘤生长曲线和生存曲线(n个 = 8）注入2 × 10⁵B16黑色素瘤细胞。**c（c）**WT和T细胞特异性KO原始CD4⁺T细胞（CD44^洛CD62L型^你好)在亚群条件下，用板结合抗CD3和抗CD28抗体刺激4天。基于细胞内细胞因子染色的流式细胞术分析T细胞分化频率。d日热图显示WT和T细胞特异性KO小鼠原始T细胞中的基础差异表达基因。**e（电子）**,**（f）**肿瘤生长曲线(**e（电子）**)和生存曲线(**（f）**)髓系细胞特异性KO(n个 = 8）小鼠注射2 × 10⁵B16黑色素瘤细胞。克,小时免疫细胞（CD45）的流式细胞术分析⁺)浸润第15天肿瘤和CD4的频率⁺T细胞，CD8⁺T细胞、巨噬细胞（CD11b⁺80层/四层⁺)，髓源性抑制细胞（MDSCs）（CD11b⁺等级-1⁺) (克)和Treg细胞（CD4⁺Foxp3系列⁺) (小时). 基于多只动物的流式细胞术数据汇总，显示肿瘤细胞总数中所示细胞群的频率（右面板）。我干扰素γ的ICS和流式细胞术分析⁺在CD8中⁺T肿瘤或dLN细胞，以代表图（左面板）和总结图（右面板）表示。j个从WT或髓系细胞特异性KO小鼠肿瘤中分离的TAM中指示基因的qRT-PCR分析。所有qRT-PCR数据均以相对于*Actb公司*mRNA水平。数据是平均值 ± 多只动物的SEM值（每个圆圈或正方形代表一只老鼠）和三个独立实验的代表。双尾未配对t吨-进行了测试**P（P）* < 0.05; ***P（P）* < 0.01

图4
线粒体分裂是诱导*伊利12a*。性别匹配的WT和FAM73b KO小鼠（8周龄）初级BMDM中FAM73b-调节基因的转录组分析。一说明WT和FAM73b KO BMDM在非治疗或LPS刺激条件下差异表达基因重叠的文氏图小时。b条热图显示WT和FAM73b KO BMDM中基础（左侧面板）和LPS反应（右侧面板）差异表达基因。使用经LPS刺激的WT或FAM73b KO BMDM对指示基因进行qRT-PCR分析(**c（c）**)或聚（I:C）(d日).e（电子）用LPS刺激12和24小时的WT或FAM73b KO BMDM上清液中指示细胞因子的ELISA 小时。**（f）**用qRT-PCR测定WT和FAM73b KO BMDC中的指示基因水平。克Mdivi-1治疗12天后LPS诱导基因变化的qRT-PCR分析小时。小时,我WT和MFN1/2-(小时)或OPA1缺陷(我)用脂质体释放的聚I:C刺激MEF 9 h.通过qRT-PCR检测所示基因。所有数据都以相对于*Actb公司*mRNA水平。数据表示为平均值 ± SEM值和至少三个独立实验的代表性。统计分析表示实验重复的变化。双尾未配对t吨-进行了测试**P（P）* < 0.05; ***P（P）* < 0.01; ****P（P）* < 0.005

图5
FAM73b缺乏促进IRF1的稳定性。一–**c（c）**全细胞裂解物中的指示蛋白质(一,b条)或细胞质（CE）和细胞核（NE）提取物(**c（c）**)通过IB分析测量WT和FAM73b KO BMDM。d日LPS刺激WT或FAM73b KO BMDM中IRF1水平的IB分析。qRT-PCR分析*红外1*WT或FAM73b KO BMDM中(**e（电子）**). DMSO或MG132预处理30天后BMDM中IRF1水平的IB分析收获前min(**（f）**).克 *伊利12a*和*伊尔6*mRNA水平通过qRT-PCR评估。小时WT和FAM73b KO BMDM感染了编码非沉默控制shRNA（C）或两种不同pGIPZ慢病毒载体*红外1*-特定shRNAs。所示基因的qRT-PCR分析。数据显示为相对于*Actb公司*mRNA水平。我用LPS刺激WT和FAM73b KO BMDM 60 min，与MG132孵育30 最小IRF1通过IP（变性条件下）分离，其泛素化形式通过IB使用抗K48连接的泛素抗体检测。蛋白裂解物也受到直接IB（底部面板）的影响。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。进行了双尾非配对t检验**P（P）* < 0.05

图6
CHIP单泛素化参与IRF1降解。一如图所示，LPS刺激后，对细胞质中的CHIP和单泛素化的CHIP以及细胞核中的IRF1进行IB分析。b条WT或FAM73b KO BMDM感染了shRNA（C）或两种不同的*存根1*-特定shRNAs。指示细胞因子的qRT-PCR分析。**c（c）**,d日用WT和突变的CHIP重组CHIP缺陷的RAW264.7细胞。**c（c）**亚细胞组分中指示蛋白质的IB分析。d日全细胞裂解物中的IRF1多泛素化。**e（电子）**qRT-PCR分析*伊利12a*和*伊尔6*重组RAW264.7细胞中的mRNA。**（f）**,克使用MG132治疗WT和FAM73b KO BMDM 30次收集前min。细胞质中CHIP单泛素化的IB分析(**（f）**)和多泛素水平(克).小时共聚焦显微镜分析CHIP位置。我线粒体或非线粒体提取物中CHIP的免疫印迹分析。使用靶向HSP60（线粒体标记物）和肌动蛋白的抗体确认线粒体部分的纯度。j个,k个用Mdivi-1治疗FAM73b KO BMDM 12次 h.用IB测定CHIP的蛋白水平和位置(j个)和共焦显微镜(k个). 这些数据代表了三个独立的实验。比例尺英寸小时和k个是10 微米。统计分析表示实验重复的变化。双尾未配对t吨-进行测试**P（P）* < 0.05

图7
帕金促进单泛素化CHIP的降解。一LPS引物WT或FAM73b KO BMDM中Parkin和自噬相关蛋白的IB分析。b条 *公园2*RT-QPCR检测mRNA。**c（c）**Parkin和线粒体共定位的共焦显微镜分析。d日用Mdivi-1预处理FAM73b KO BMDM 12次 h.通过IB检测到Parkin水平。**e（电子）**采用RT-QPCR检测Parkin KO BMDM中的细胞因子诱导。**（f）**IB分析细胞质中CHIP和IRF1蛋白水平及修饰。克,小时细胞质中CHIP的单泛素化(克)和细胞因子诱导(小时)在中执行*停车场2*-沉默的BMDM。我在与编码所示基因的质粒共同转染的HEK293T细胞中进行Parkin–CHIP相互作用分析。用MG132处理后，使用抗HA对全细胞裂解物进行IP处理，然后使用抗FLAG对相关的FLAG-CHIP进行IB分析。j个用总泛素质粒和指示的表达质粒转染HEK293T细胞。用IP分离FLAG标记的CHIP，然后用IB检测多泛素化的CHIP。这些数据是三个独立实验的代表。比例尺输入**c（c）**是10 微米。双尾未配对t吨-进行了测试**P（P）* < 0.05

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