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.2017年11月27日；13（11）：e1006747。
doi:10.1371/journal.ppat.1006747。 eCollection 2017年11月。

细胞内克氏锥虫无鞭毛体对宿主中枢碳代谢和原位葡萄糖摄取的调节

希娜·沙赫·辛普森 1, 盖尔·伦蒂尼 1, 彼得·杜穆林 1, 芭芭拉·A·伯利 1
附属公司

细胞内克氏锥虫无鞭毛体对宿主中枢碳代谢和原位葡萄糖摄取的调节

希娜·沙赫·辛普森等。 公共科学图书馆-病理学. .

摘要

强制性细胞内病原体通过与宿主代谢过程耦合来满足其营养需求，通常通过调节这些途径来促进关键代谢产物的获取。这种代谢依赖性是病原体控制的潜在靶点，但对于细胞内原生动物寄生虫和恰加斯病病原体克氏锥虫来说，基本上没有特征。据报道，在哺乳动物克氏锥虫感染中，宿主中枢碳和能量代谢受到干扰，但没有关于宿主代谢变化对细胞内无鞭毛虫生命阶段的影响的信息。在这里，我们进行了基于细胞的研究，以阐明细胞内克氏锥虫无鞭毛体感染与宿主细胞能量代谢之间的相互作用。克氏锥虫感染非吞噬细胞的特征是增加了被感染细胞的葡萄糖吸收，增加了线粒体呼吸和线粒体生物生成。虽然细胞内无鞭毛体的生长不受宿主呼吸能力下降的影响，但胞外葡萄糖的限制会损害无鞭毛细胞的增殖，并使寄生虫对2-脱氧葡萄糖的进一步生长抑制敏感。这些观察结果使我们考虑了细胞内克氏无鞭毛虫是否直接利用葡萄糖作为底物来促进新陈代谢。与这一预测一致，分离的克氏无鞭毛虫以类似于胰头线虫的动力学转运细胞外葡萄糖，随后的代谢如13C-葡萄糖标记和底物利用分析所示。克鲁兹锥虫感染细胞的代谢标记进一步证明了细胞内寄生虫原位进入宿主己糖库的能力。这些发现与细胞内克氏无鞭毛虫利用宿主对寄生虫感染的代谢反应（包括葡萄糖摄取的增加）来促进自身在宿主细胞液中的代谢和复制的模型一致。我们的发现丰富了目前关于细胞内克鲁兹无鞭毛虫可用碳源的观点，并强调了这种病原体的代谢灵活性，这一特征被预测为哺乳动物宿主中具有不同代谢特征的组织成功定殖的基础。

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数字

图1
图1。T型.克鲁齐感染增加宿主细胞的葡萄糖摄取。
（A）吸纳[三H] -2-脱氧葡萄糖([三H] -2-DG）进入未感染或T型.克鲁齐-感染后48小时（48 hpi）感染的NHDF单层，其中感染是以不同的多重感染（MOI）建立的。每个MOI显示3个生物重复的平均值±SD。采用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett多重比较试验对未感染对照组进行个体比较（*p<0.05，***p<0.0001）。（B）细胞降钙素B（10μM）阻止[三H] -未感染和感染NHDF单层中的2-DG（48 hpi）。3个生物重复的平均值±SD。采用双向方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较检验（****p<.0001）.（C）[三H] NHDF摄取2-DG或（D）感染48小时后的C2C12成肌细胞T型.克鲁齐Tulahuén、CL-Brener或CL-14菌株。NHDF用MOI 40感染Tulahuén株2小时，MOI 150感染CL-Brener和CL-14株2小时。用MOI 80感染C2C12的Tulahuén株，用MOI 150感染CL-Brener和CL-14株，感染时间为2小时。3个生物重复的平均值±SD。采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验对未感染对照组进行个体比较（**p<0.01，**p<0.001，***p<0.0001）。
图2
图2。T型.克鲁齐感染增加了寄主线粒体含量和呼吸。
（A）在未感染和T型.克鲁齐-受感染的NHDF单层（48 hpi）。平均值±标准偏差显示为每个重复2次。采用学生t检验。（B）未感染和T型.克鲁齐-注射寡霉素（O）、FCCP（F）、鱼藤酮和抗霉素A（R/A）前后受感染的NHDF单层（48hpi）。4个生物重复的平均值±SD。（C） T型.克鲁齐-用1μM ELQ300处理受感染的NHDF单层，以选择性地从总OCR信号中去除无鞭毛呼吸（受感染的，±ELQ300）。期间宿主呼吸增加T型.克鲁齐感染（感染，+ELQ300）。每个条件下4个生物重复的平均值±标准差。采用双向方差分析和Tukey多重比较检验（*p<0.05，***p<0.001，***p<0.0001）。（D）NHDF和C2C12成肌细胞中与未感染对照组相比，每种情况下线粒体mCherry信号的几何平均荧光强度。根据T型.克鲁齐GFP表达（S2D图）和每个亚群的几何平均mCherry荧光测定（S2E图）。2个独立实验的平均值±SD。采用Dunnett多重比较检验的双向方差分析（*p<0.05，**p<0.01）。
图3
图3。细胞内T型.克鲁齐复制对外源葡萄糖敏感，但对宿主线粒体电子传递链活性不敏感。
（A）扩散T型.克鲁齐ETC复合物III缺陷（CIII突变）的人皮肤成纤维细胞或两个独立对照成纤维细胞系（正常1和2）中的无鞭毛体来源于流式细胞术数据（详见方法）。将数据归一化，以表示初始无鞭毛菌（18 hpi）的百分比，该百分比将指示的次数除以48 hpi。2个独立实验的平均值±SD。虚线表示每种情况下48 hpi完成无鞭毛体分裂的平均数。（B）扩散T型.克鲁齐NHDF中无鞭毛菌在不同葡萄糖浓度的培养基中培养。点线表示通过流式细胞术对CFSE标记的寄生虫进行测定，48 hpi达到的无鞭毛分裂平均数。（C）剂量依赖性抑制T型.克鲁齐在不同葡萄糖浓度下，通过2-脱氧葡萄糖（2-DG）在NHDF中生长。的相对数量T型.克鲁齐-通过Beta-Glo发光在66 hpi下评估半乳糖苷酶寄生虫，使用对数（抑制剂）与可变斜率响应进行非线性拟合。每点4个生物重复的平均值±SD。（D）逮捕T型.克鲁齐在葡萄糖消耗条件下，2 mM 2-DG存在下NHDF中无鞭毛增殖。点线表示通过流式细胞术对CFSE标记的寄生虫进行测定，48 hpi达到的无鞭毛分裂平均数。（E）与面板D中使用的条件相对应的醛固定、DAPI染色NHDF单层的荧光显微照片，在该面板中，很容易观察到宿主细胞核（大）和寄生虫DNA（小点）。箭头指向2个细胞内无鞭毛虫，它们在因停糖和2-DG治疗引起的严重生长限制后持续存在。
图4
图4。细胞内葡萄糖的获取和代谢T型.克鲁齐无鞭毛虫。
隔离的T型.克鲁齐无鞭毛菌利用外源底物（A）耗氧率（OCR）和（B）细胞外酸化率（ECAR）。确定基线速率后，注射葡萄糖（5 mM）、谷氨酰胺（5 mM）或缓冲液作为底物（sub），然后注射100 mM 2-DG以快速抑制糖酵解，并注射1μM鱼藤酮和抗霉素A（R/A）以关闭线粒体呼吸。3个生物复制品的平均值±SD。（C）初始速率（V0)第页，共页[三H] -通过隔离吸收2-DGT型.克鲁齐无鞭毛菌或色柱头菌绘制了一系列底物浓度。每个生命周期阶段显示的两个独立实验的平均值±SD，生物重复。插图显示Lineweaver-Burk图。（D）细胞内T型.克鲁齐无鞭毛菌接触外源己糖就地.T型.克鲁齐-感染的单层细胞用10μCi孵育[三H] 在不存在或存在细胞松弛素B（15μM）的情况下，在分离细胞内无鞭毛体进行闪烁计数之前，持续20分钟。两个独立实验的平均值±SD。采用学生t检验（**p<0.01）。（E）[三H] -2-DG由细胞内无鞭毛体内化。从单层膜中分离出脉冲[三H] -2-DG，用0.05 mg/mL甲氧西丁释放的内化非结合底物治疗无鞭毛菌。两个独立实验的平均值±SD。（F）在与指示的碳底物孵育24小时后，相对于新分离寄生虫的初始ATP水平，在细胞内衍生无鞭毛虫中测得的ATP水平。每个条件下3个生物重复的平均值±SD。采用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett多重比较检验对底物缺乏情况进行个体比较（***p<0.001，***p<0.0001）。
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