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.2017年12月4日；27（23）：3626-3642.e6。
doi:10.1016/j.cub.2017.10.054。 Epub 2017年11月22日。

典型自噬-溶酶体途径中的停滞促进神经退行性变中基于核吞噬的核破坏

奥尔加男爵 1, 阿德尔·布迪 1, 卡塔琳娜·迪亚斯 1, 迈克尔·席林 1, 安娜·诺勒 2, Gema Vizcay-Barrena公司 3, 伊凡Rattray 4, 海因茨·容布鲁斯 5, Wiep Scheper公司 2, 罗兰·A·弗莱克 3, 吉莉安·贝茨 6, Manolis Fanto公司 7
附属公司

典型自噬-溶酶体途径中的停滞促进神经退行性变中基于核吞噬的核破坏

奥尔加男爵等。 当前生物. .

摘要

神经退行性疾病中神经元退行性变和死亡的终末期仍然难以捉摸。自噬是一个重要的分解代谢过程，在神经退行性变中经常失败。最近出现了选择性自噬途径，包括核吞噬，定义为自噬对核成分的降解。在这里，我们表明，在多聚谷氨酰胺病（DRPLA）小鼠模型中，共济失调表型的逐渐获得与严重的小脑细胞病理学有关，其特征是通过基于核吞噬的层粘连蛋白B1降解和排泄导致核变性。我们发现DRPLA小鼠和DRPLA患者的人成纤维细胞中的典型自噬停滞。p62的积累和LC3-I/II转化的下调以及Tfeb表达的降低证明了这一点。几种情况下的慢性自噬阻滞，包括DRPLA和Vici综合征（一种早期自溶体病理学），导致替代清除途径的激活，包括高尔基体膜相关和基于核吞噬的LaminB1降解和排泄。这些替代途径和典型的自噬阻断结合在一起，导致严重的核病理学和核组织破坏，导致终末细胞萎缩和变性。因此，我们的发现为人类神经退行性疾病中神经元细胞变性和死亡的终末期确定了一种新的渐进机制，并提供了自噬阻滞、替代降解途径激活和细胞成分排泄之间的联系。

关键词：萎缩蛋白-1；EPG5；自噬；神经变性；噬核；聚谷氨酰胺。

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数字

图1
图1
DRPLA小鼠行为评估（A–D）握力分析显示，与野生型小鼠（WT，黑色）和ATN1-FL-26Q（蓝色）相比，ATN1-FL-65Q小鼠（红色）随着时间的推移出现退化性下降，这是通过重复测量双向方差分析测得的。年龄（v1）和基因型（v2）之间的显著交互作用证明了这一点(X（X）p<0.05，XX年p<0.01，XXX（XXX）p<0.001）。因此，与女性相比，男性患者的进展更为强烈，表现为双侧（B）的互动更强（A）。此外，仅测量前肢握力时，男性表现出进步（D）。相反，女性前肢非渐进性握力水平总体下降（C）。单个值以平均值±SEM表示，单个时间点的显著性水平如上所示∗p<0.05，∗∗p<0.01，且∗∗∗p<0.001。（E） 通过评估10周龄的雄性和雌性在外区的时间，评估其在进入开阔场地后的前5分钟内的趋性焦虑程度。与野生型（wt；黑色）和ATN1-FL-26Q（26Q；蓝色）小鼠相比，ATN1-FL-65Q（65Q，红色）小鼠表现出明显更倾向于靠近竞技场墙壁。使用EthoVision 7XT软件自动量化。单向方差分析，∗∗p<0.01。（F） 在10周和14周时，对雌性大鼠的一般活动进行评估，评估其进入开阔场地后5至25分钟的运动距离。在10周时，ATN1-FL-26Q（蓝色）小鼠比野生型（WT；黑色）小鼠更活跃。这种差异在14周龄时更为明显，ATN1-FL-26Q和ATN1-FL-65Q（红色）品系的活性均高于野生型，而ATN1-FL-65Q小鼠的活性低于ATN1-FLA-26Q。未观察到与年龄的交互作用（重复测量双向方差分析，v1，基因型；v2，年龄）。使用EthoVision 7XT软件自动量化。单因素方差分析∗p<0.05，∗∗p<0.01，以及∗∗∗p<0.001。（G） 在18周龄时的步态分析中，ATN1-FL-26Q显示出一种典型的协调和规则脚印，将后爪（红色）靠近前爪（蓝色）。相反，ATN1-FL-65Q表现出共济失调典型的不协调模式。另请参见图S1。
图2
图2
DRPLA小鼠终末期齿状核细胞中未消化自噬结构的积累（A–C）与野生型（A）相比，ATN1-FL-65Q（C）小鼠齿状核中脂褐素样自噬荧光的积累增加，而ATN1-FL-26Q（B）小鼠的增加水平较低。共焦激光扫描显微镜图像λex=514和633。比例尺，10μm。定量见图S1G；自荧光漂白示例见图S2A。（D–F）DN细胞的低放大TEM图像显示，与野生型（WT，D）和ATN1-FL-26Q（E）小鼠相比，ATN1-FL-65Q小鼠（F）中的三级溶酶体以电子致密的囊泡结构堆积，并带有透明的脂质内含物，称为脂褐素（红箭头）。细胞核；线粒体；内质网；mb、质膜。比例尺，1μm。图5B显示了（F）的高倍图像。三级（晚期）溶酶体的（G和H）高放大TEM图像类似于典型的脂褐素包裹的电子致密层状基质结构，其中囊状脂质包涵体为电子透明的圆形结构。（G） ATN1-FL-65Q和（H）野生型（WT）。线粒体。比例尺，500纳米。（一） 高放大TEM图像显示，在ATN1-FL-65Q齿状核细胞（通常称为多层体）中观察到由多层膜（黑色箭头）包围的致密堆积物。比例尺，500 nm（J）显示第三溶酶体（红色箭头）和双膜自噬小泡（黑色箭头）多次堆积的细胞示例，其中含有ATN1-FL-65Q齿状核细胞中常见的未消化碎片。比例尺，1μm。图5A显示了原子核的低倍表示。（K） 放大（J）中的插图，显示两个双层囊泡结构（黑色箭头），其中包含未消化的物质。比例尺，500 nm。（L） 自噬体的高倍图像（箭头），是一个包含几个内体的双膜囊泡结构（全箭头）和一个未消化的前线粒体（带框箭头）。比例尺，500 nm。（M） WT中齿状核细胞的代表性图像；GFP-LC3，ATN1-FL-26Q；GFP-LC3和ATN1-FL-65Q；评估GFP（绿色）和LAMP2a（红色）阳性以及共定位（黄色）斑点的GFP-LC3终末期小鼠。点状细胞在细胞体内计数，显示DN神经元的典型形态，其大的低强度细胞核（蓝色）被相对较大的细胞质包围，LAMP2a阳性背景较高。使用Axiovert外荧光显微镜在细胞核水平上拍摄图像，使用Apotome光学切片，在100倍物镜放大率下进行高网格。比例尺，10μm。（N） WT齿状核细胞中GFP阳性斑点的定量研究；GFP-LC3（重量），ATN1-FL-26Q；GFP-LC3（26Q）和ATN1-FL-65Q；GFP-LC3（65Q）小鼠处于3周前症状期（wt，n=83个细胞，3只动物；26Q，n=77个细胞，三只动物；65Q，n=96个细胞，四只动物）和终末期（wt、n=53个细胞，三只动物；2Q，n=39个细胞，叁只动物；6Q，n=22个细胞，三百只动物）。单向方差分析，平均值±SEM，∗∗∗p<0.001，∗∗p<0.01。（O） GFP-LC3和LAMP2a点状阳性与仅GFP-LC2点状阳性在3周和终末期WT齿状核细胞中的相对共定位比率；GFP-LC3（重量），ATN1-FL-26Q；GFP-LC3（26Q）和ATN1-FL-65Q；GFP-LC3（65Q）小鼠。单向方差分析，平均值±SEM，∗∗p<0.01，∗p<0.05。另请参见图S2。
图3
图3
溶酶体水平的自噬流量抑制和DRPLA中自噬起始信号的降低（A–C）在14周龄小脑裂解物上清液部分中全长GFP-LC3的蛋白质印迹分析中，LC3II与LC3I的比率用于量化自噬流量（A）。抗LC3抗体识别35至55 kDa之间的双链（图S4B），与GFP-LC3-I（上部）和裂解的GFP-LC3-II（下部）一致。使用Atg5-12缀合物的水平来量化自噬起始的事件。密度分析显示，ATN1-FL-65Q中裂解GFP-LC3-II到全长GFP-LC3-I（B）的相对丰度降低；GFP-LC3（65Q）小鼠与ATN1-FL-26Q小鼠的比较；GFP-LC3（26Q）和WT；GFP-LC3（wt）小鼠。ATN1-FL-65Q中的Atg5-12共轭物（C）也减少；GFP-LC3（65Q）与WT的比较；GFP-LC3（重量）。学生t检验，平均值±SEM，∗∗p<0.01，∗p<0.05。（D–F）在14周龄小脑裂解物的蛋白质印迹分析中，分析了GFP切割产物和自噬受体p62的积累，作为自噬流量阻断的衡量标准（D）。小鼠抗GFP抗体仅识别GFP-LC3-II（图S4B），并在长时间暴露后裂解GFP。∗抗GFP信号暴露时间更短。WT中劈开的GFP相对于GFP-LC3-II（E）的相对丰度以及p62相对于α-微管蛋白（F）的丰度的密度分析；GFP-LC3小鼠（wt），ATN1-FL-26Q；GFP-LC3（26Q）和ATN1-FL-65Q；GFP-LC3（65Q）小鼠。学生t检验，平均值±SEM，∗p<0.05。（G） 因此，自噬的western blot分析显示，与野生型（WT）相比，终末期ATN1-FL-65Q小鼠的自噬通量停滞，表现为GFP-LC3-II的相对减少以及颗粒部分p62的增加。∗在终末期小鼠小脑上清液部分，抗p62抗体显示，在约～60 kDa处，比预期带高出20 kDa的额外带。（H） qPCR分析特菲布野生型（wt，白色）、ATN1-FL-26Q（26Q，蓝色）和ATN1-FL-65Q小鼠（65Q，红色）在症状前（3周）和症状早期（10周）时间点的小脑mRNA水平。相对水平标准化为β-肌动蛋白和Hprt1（小时）以野生型褶皱变化给出。双向方差分析，v1，基因型；v2，年龄，平均值±SEM（n=6），∗∗∗p<0.001。（I和J）14周龄时小脑裂解物上清液部分的Tfeb蛋白水平（I）。密度分析（J）显示ATN1-FL-65Q显著降低；GFP-LC3（65Q）与WT的比较；GFP-LC3（重量）。单向方差分析，平均值±SEM，∗∗p<0.05。（K） qPCR分析Ctsb和Prkag在早期症状（10周）时间点，野生型（wt，白色）、ATN1-FL-26Q（26Q，蓝色）和ATN1-FL-65Q小鼠（65Q，红色）小脑中的mRNA水平。相对水平标准化为Hprt1（小时）作为野生型的倍数变化给出。单向方差分析，平均值±SEM（n=6），∗p<0.05，∗∗p<0.01，∗∗∗p<0.001。（五十） 对来自健康对照组和DRPLA患者的人成纤维细胞的全细胞裂解物进行内源性LC3-I和LC3-II以及p62的western blot分析。与DMSO相比，Rap诱导自噬和BafA1阻断6小时导致对照组成纤维细胞中LC3II增加，而DRPLA患者样本中未观察到急性反应。急性治疗6小时后，p62水平无明显变化。（M和N）用串联RFP-GFP-LC3B报告子转染对照组和DRPLA成纤维细胞（DRPLA 17）的自噬通量分析。在Hank’s平衡盐溶液（HBSS）培养基中饥饿诱导自噬，BafA1处理抑制溶酶体降解。RFP和GFP双重荧光标记的自噬体为黄色信号。由于GFP信号在酸性环境中熄灭，自溶体只显示RFP荧光。在HBSS中饥饿3小时后，用Nikon旋转盘共聚焦显微镜获得的代表性图像显示，与DRPLA相比，对照成纤维细胞中有更多的自噬体和自溶体（M）。（N）中的定量显示，对照组的自噬体和自溶体显著增加，但饥饿后DRPLA细胞中的自噬体和自溶体没有显著增加。向饥饿培养基中添加BafA1导致GFP数量增加+招标书+点刺与仅在对照细胞中饥饿相比。DRPLA患者成纤维细胞无明显变化（见图S6H）。列中的显著性值显示了RFP的补料与饥饿状态以及饥饿与+BafA1状态的差异+或GFP+招标书+点。单向方差分析，平均值±SEM，∗p<0.05，∗∗∗p<0.001。水平条上方显示了控制和DRPLA细胞之间的总体穿孔显著性值，双向方差分析∗∗∗p<0.001；v1，基因型；v2，-总GFP+和GFP+招标书+点。比例尺，20μm。参见图S3和S4。
图4
图4
小鼠核完整性丧失果蝇属野生型（WT，顶部）和ATN1-FL-65Q（底部）小鼠齿状核细胞的DRPLA模型和DRPLA患者成纤维细胞（A）TEM图像。后者显示出不规则形状的细胞核，其中电子致密结构（异染色质）在外围凸出（箭头），具有电子透明的空泡状结构（箭头）。细胞核。比例尺，5μm。（B和C）过度表达果蝇属polyQ阿托品和LacZ公司作为对照，在成人胶质细胞和神经元细胞中使用UAS-Gal4系统回购和埃拉夫发起人。通过利用普遍表达的温度敏感性，在完全发育的成年苍蝇中诱导表达14天镀锌4阻遏物UbiGal80型时间并在29°C下灭活。共焦图像果蝇属层压板B显示不规则层压板（箭头）sAtro75QN公司与LacZ公司表达苍蝇（B），这反映在圆度的显著损失上（图像J，颗粒分析）：平均值±扫描电镜，n=5，学生t检验∗∗∗p<0.001（C）。（D–G）用Rap和BafA1治疗48小时后，DRPLA（17）患者成纤维细胞和年龄匹配的对照组细胞核形状动力学分析。典型的图像显示，在对照组和DRPLA中用BafA1处理后，aLaminB1抗体显示出核膜折叠（箭头所示），而在DRPLA成纤维细胞中由Rap诱导折叠（箭头）（D）。在对照组和DRPLA细胞（E）中，治疗后细胞核尺寸减小反映了结构变化。DRPLA细胞的核圆度降低，而对照组（F）则增加。圆度与面积的关系图显示了BafA1处理后对照组和DRPLA核的相反趋势和收敛（G）。使用Opera Phenix高含量筛选系统和Columbus软件进行自动定量。平均值±SEM，n=5，双向-ANOVA∗∗∗p<0.001，∗p<0.05；v1，基因型；v2，治疗。比例尺，50μm。另请参见图S5。
图5
图5
基于层粘连蛋白的噬核作用与DRPLA小鼠的PolyQ内含物相关，并在溶酶体阻滞（A–C）后在人DRPLA成纤维细胞中加剧；GFP-LC3（WT，左），ATN1-FL-26Q；GFP-LC3（中间）和ATN1-FL-65Q；GFP-LC3（右）终末期小鼠在细胞核（框状箭头），特别是ATN1-FL-65Q细胞（A）的细胞质（全箭头）中显示GFP-LC2（绿色）和LaminB1（红色）的共同定位（黄色）。细胞核以蓝色显示。用共焦激光扫描显微镜拍摄单面图像。定量分析表明ATN1-FL-65Q中细胞质层粘连蛋白B1（B）的数量及其与GFP-LC3（C）的共定位显著增加；与野生型相比，GFP-LC3小鼠；GFP-LC3和ATN1-FL-26Q；GFP-LC3。单向-ANOVA∗∗∗p<0.001，∗p<0.05。比例尺，5μm。（D） ATN1-FL-65Q中的一些核；GFP-LC3表现出强烈的变性，反映在LaminB1重组形成明亮的核内点状突起。核内（框状箭头）和细胞质（全箭头）层压板B1点状物与PolyQ阳性点状物共存。比例尺，5μm。（E和F）用Rap和BafA1治疗48和72小时后，DRPLA患者成纤维细胞和年龄匹配的对照组中LaminB1重新分布到细胞质的分析。有代表性的图像显示，72小时处理后的细胞被α-层粘连蛋白B1抗体（E）可视化。在用BafA1处理后，对照（白色）和DRPLA（红色）成纤维细胞在48和72小时后均显示层粘连B1阳性点状增加，而Rap仅在DRPLA成纤维细胞中在72小时后增加细胞质层粘连B1点状（F）。与mTOR对增殖的抑制作用一致，Rap导致相对细胞数显著减少（p<0.001未显示）。与对照组相比，BafA1处理48小时仅导致DRPLA样品中的细胞数量减少，而72小时后，对照组和DRPLA样本中的细胞数均显著减少。使用Opera Phenix高含量筛选系统和Columbus软件进行自动定量。平均值±SEM，双向-ANOVA∗∗∗p<0.001。比例尺，50μm。另请参见图S6。
图6
图6
类聚集物的形成和高尔基体介导的降解是DRPLA小鼠齿状核选择性自噬诱导的标志（A）（i）ATN1-FL-65Q小鼠齿状细胞核的TEM图像，其中靠近细胞核（nuc）有膜聚集物（Agg）。比例尺，5μm。（ii）（i）中含有类凝集素（Agg）膜结构的插图放大倍率更高。比例尺，500 nm。ly，溶酶体；线粒体。（iii和iii’）ATN1-FL-65Q中DN细胞的共焦荧光图像；GFP-LC3小鼠脑内p62阳性（红色）内含物位于细胞核内（蓝色）以及细胞核外（箭头），也与GFP-LC2（绿色）共存。（B） （i）ATN1-FL-65Q小鼠齿状核细胞的TEM图像；除了大的核周类聚集物（Agg）结构外，细胞体的远端还显示出具有吞噬细胞结构的长膜结构（箭头）。比例尺，2μm（注意，这是图2F中图像的一个放大倍数较高的剪切块）。（ii）类似吞噬类结构的高放大TEM图像。比例尺，300 nm。（C） 与ATN1-FL-26Q（中）和野生型（WT，左）小鼠正常高尔基体形态相比，ATN1-FL-65Q小鼠（右）齿状核细胞的典型TEM图像显示，双膜泡状结构（箭头）靠近高尔基体（箭头）。标尺，500 nm（D和E）齿状核细胞的共焦荧光显微镜图像，显示ATN1-FL-65Q中的高尔基体扩大（GM130，红色）；GFP-LC3小鼠系（左）与ATN1-FL-26Q的比较；GFP-LC3系（中）和野生型；GFP-LC3（WT，右侧）（D）。最下面一行的插图显示了GFP-LC3（绿色）阳性点在GM-130阳性结构附近的更高放大倍数。比例尺，5μm。GM130信号的定量显示ATN1-FL-65Q增加；GFP-LC3鼠标线（E）。Kruskal-Wallis多重比较分析，平均值±SEM，∗∗∗p<0.001（F和G）使用BafA1和/或BrefA治疗48小时后，DRPLA（17）患者成纤维细胞中LaminB1重新分布到细胞质的分析。BrefA仅在最后24小时添加。BafA1和BrefA显示层粘连蛋白B1在细胞质中的定位增加，呈现不同的分布模式：BafA1处理后扩散，BrefA处理后集中在大的核周点状物中。BafA1和BrefA联合处理对细胞质层压板B1定位具有协同作用。比例尺，50μm（F）。使用Opera Phenix高含量筛选系统和Columbus软件对细胞质中LaminB1阳性点状物所占面积进行自动定量。平均值±SEM，双向方差分析∗∗∗p<0.001，∗∗p<0.01，∗p<0.05。另请参见图S7。
图7
图7
自噬和高尔基体损伤后富含层粘连蛋白B1的芽的排泄（A）典型图像，显示72小时Rap处理后DRPLA（17）成纤维细胞，显示在含有层粘连肽B1和p62点的质膜上形成芽。图像中插图的高倍显示在左侧。比例尺，25μm。（B） 表达EGFP和mCherry-LaminB1的SK-N-BE（3）神经母细胞瘤细胞经BafA1处理48小时的共聚焦实时成像静止帧（取自电影S3）。箭头指向一个与细胞核分离的层粘连蛋白B1点状突起，并随着时间的推移逐渐排泄。注意畸形的细胞核和层压板B1内折。比例尺，5μm。（C） 共表达EGFP和mCherry-LaminB1的SK-N-BE（2）神经母细胞瘤细胞胞外LaminB1和siRNAs的分析自动液位计5或ATG6，参与自噬和ATG依赖性分泌的基因。胞外LaminB1-mCherry puncta富集于周围区域，使EGFP阳性细胞空洞中无EGFP信号。使用Opera Phenix高含量筛选系统和Columbus软件对mCherry信号强度进行自动量化。平均值±SEM，单向-ANOVA∗p<0.05。（D–G）分析用BafA1和BrefA处理的人DRPLA（17）成纤维细胞培养基中细胞成分的排泄，如图6F所示。收集培养基上清液并进行超速离心，同时对细胞进行裂解，分离细胞核和细胞质部分。BafA1和BafA1/BrefA联合处理增加了细胞质组分（D和E）中LaminB1的数量。BafA1显著增加了100000×克超速离心；添加BrefA并没有显著降低该组分中发现的LaminB1或p62的数量。注意，细胞质和培养基上清液部分中的LaminB1带的分子量较低，为~45 kDa，而细胞核部分中的预期分子量为~70 kDa，与蛋白水解切割相容。培养基上清液组分的密度测定标准化为细胞质微管蛋白，该微管蛋白代表培养物中细胞和细胞质的数量。一个样本t检验，平均值±SEM，∗∗p<0.01，∗p<0.05。（H） 表达EGFP、mCherry-LaminB1和Atg6 siRNA的SK-N-BE（2）神经母细胞瘤细胞的代表性图像显示相邻细胞摄取LaminB1点。箭头指向未转染细胞内发现的mCherry-LaminB1点。磷脂酶用于标记所有细胞的细胞质区域。比例尺，10μm。另请参见图S7。
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