Coupling of Polo kinase activation to nuclear localization by a bifunctional NLS is required during mitotic entry

doi:10.1038/s41467-017-01876-8

.2017年11月22日；8(1):1701.

doi:10.1038/s41467-017-01876-8。

在有丝分裂进入过程中，需要通过双功能NLS将Polo激酶激活与核定位偶联

大卫·卡切纳^1 2, 达米安·加里多^1 2, 海瑟姆·梅森¹, 卡琳·诺曼丁¹, 雨果·拉沃伊¹, 文森特·阿尔坎鲍尔^3 4

附属公司

¹加拿大蒙特利尔大学免疫与癌症研究所，C.P.6128 Succursale Centre-Ville，Montréal，QC，H3C 3J7。
²加拿大魁北克省蒙特利尔Succursale Centre Ville，C.P.6128，Montréal，Universityéde Montrèal，生物芯片与分子生物学研究所，H3C 3J7。
³加拿大蒙特利尔大学免疫与癌症研究所，C.P.6128 Succursale Centre-Ville，Montréal，QC，H3C 3J7。vincent.arcambault.1@umontreal.ca。
⁴加拿大魁北克省蒙特利尔Succursale Centre Ville，C.P.6128，Montréal，Universityéde Montrèal，生物芯片与分子生物学研究所，H3C 3J7。vincent.arcambault.1@umontreal.ca。

PMID： 29167465
预防性维修识别码： PMC5700101型
内政部： 10.1038/s41467-017-01876-8

在有丝分裂进入过程中，需要通过双功能NLS将Polo激酶激活与核定位耦合

大卫·卡切纳等。国家公社. 2017.

.2017年11月22日；8(1):1701.

doi:10.1038/s41467-017-01876-8。

作者

大卫·卡查纳^1 2, 达米安·加里多^1 2, 海瑟姆·梅森¹, 卡琳·诺曼丁¹, 雨果·拉沃伊¹, 文森特·阿尔坎鲍尔^3 4

附属公司

¹加拿大蒙特利尔大学免疫与癌症研究所，C.P.6128 Succursale Centre-Ville，Montréal，QC，H3C 3J7。
²加拿大魁北克省蒙特利尔Succursale Centre Ville，C.P.6128，Montréal，Universityéde Montrèal，生物芯片与分子生物学研究所，H3C 3J7。
³加拿大蒙特利尔大学免疫与癌症研究所，C.P.6128 Succursale Centre-Ville，Montréal，QC，H3C 3J7。vincent.arcambault.1@umontreal.ca。
⁴加拿大魁北克省蒙特利尔Succursale Centre Ville，C.P.6128，Montréal，Universityéde Montrèal，生物芯片与分子生物学研究所，H3C 3J7。vincent.arcambault.1@umontreal.ca。

PMID： 29167465
预防性维修识别码： PMC5700101型
内政部： 10.1038/s41467-017-01876-8

摘要

Polo激酶是酵母对人类有丝分裂和胞质分裂的主要调节因子。Polo由一个N项激酶域（KD）和一个C项Polo-box域（PBD）组成，调节其亚细胞定位。PBD和KD可以相互作用和抑制，当Polo在其激活环被磷酸化时，这种相互抑制被解除。在有丝分裂进入过程中Polo激活和定位是如何耦合的尚不清楚。这里我们报告了PBD与KD的结合掩盖了核定位信号（NLS）。激活KD的磷酸化导致NLS暴露和Polo在核膜破裂前进入细胞核。这一机制的失败会导致激活Cdk1的Cdc25磷酸酶的失调，并导致果蝇的有丝分裂和发育缺陷。这些结果揭示了有丝分裂进入期间连接主调节酶的时空机制。

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作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1
Polo激酶结构域中的活化磷酸化位点控制其核定位。一表达Polo的合胞胚^重量-绿色荧光蛋白，Polo^T182A型-GFP或Polo^T182D型-通过延时显微镜观察GFP。N：细胞核；箭头：中心体；黄色箭头：着丝粒/动粒；绿色箭头：中环。条：10 微米。b条表达Polo的稳定细胞系的时间推移成像^重量-GFP、Polo^T182A型-GFP或Polo^T182D型-带RFP-Lamin的GFP。在着丝粒（绿色框中的绿色箭头和放大图像，右侧）初始检测Polo-GFP和NEB之间的时间(吨 ₀)如图所示。当RFP-拉明开始溶解到细胞质中时，测定NEB。酒吧：5 微米。**c（c）**NEB前一段时间内GFP荧光比率（细胞核/总细胞）的量化，来自b条. (n个 = 10，误差条：SD）。d日双核2治疗后的定量，如**c（c）**图像参见补充图2a–d***P（P）* < 0.01; ****P（P）* < 0.001; 学生的t吨测试，在Polo之间^重量-GFP公司 + 二甲基亚砜与双核2

图2
Polo的核聚积取决于被PBD掩盖的NLS。一不同物种Polo序列的比对显示KD中包含NLS1和NLS2基序的保守二分NLS。b条,**c（c）**表达Polo的稳定细胞系的时间推移成像^{荷兰标准7A}-GFP和Polo^{T182D，NLS7A}-带RFP-Lamin的GFP。酒吧：5 微米。d日在NEB之前测量GFP荧光比率（细胞核/总细胞）(n个 = 10，误差条：SD）。**e（电子）**表达Polo的合胞胚^NLS7A型-用延时显微镜观察GFP。N：细胞核；箭头：中心体；箭头：中圈。条形图：10 微米。**（f）**斑马鱼Plk1的KD（绿色）和PBD（青色）与来自*果蝇属*Map205（红色）（蛋白质数据库登录号4J7B）。显示了NLS1和NLS2残基周围的表面积（深绿色），以突出它们与PBD的相互作用。特写显示NLS残留物和PBD（顶部）之间的界面，以及顺时针旋转90°的同一表面（底部）。克虚线框强调了NLS1和斑马鱼Plk1（1）中PBD肽之间的相互作用以及NLS2和PBD之间的氢键（2）和疏水堆积（3）的细节。参与界面的残留物用木棍画出并贴上标签。等效残留物*果蝇属*本研究中变异的Polo（图3）在括号中。氢键用红色虚线表示。干预水分子用十字表示。使用PyMOL 1.4内置命令执行结构渲染

图3
Polo激酶活性、NLS功能和PBD功能之间的相互依赖性。一NLS残基突变或T182D取代消除KD–PBD相互作用。如图所示，GST-PBD或GST-结合的sepharose珠与转染不同形式的Flag-KD（含IDL）的细胞裂解液孵育。通过western blots分析下拉产品。b条NLS残基突变或T182D取代消除Polo-Map205相互作用。按照指示转染细胞，纯化PrA-Map205。样品通过western blotting进行分析。**c（c）**生物发光共振能量转移（BRET）揭示了T182D和NLS7A突变对活细胞KD-PBD相互作用的影响。用固定量的Luc-KD（含IDL）表达载体和增加量的PBD-GFP表达载体转染HEK293T细胞。共转染第三个表达Map205片段（Map）的质粒，稳定PBD–KD复合物。当KD和PBD相互作用时，荧光素酶（Luc）部分在与柯烯特拉嗪反应后将能量转移到GFP，然后荧光（BRET）。BRET的差异₅₀（BRET达到一半最大的GFP/Luc比率）反映了亲和力的差异。非盟任意单位。误差线：代表性实验的三个重复值的标准偏差。d日NLS残基突变增加Polo激酶活性。免疫沉淀Polo-GFP（WT和突变体）用于以酪蛋白为底物的激酶反应。对于Polo抑制，在300 纳米。通过放射自显影、蛋白质印迹和酰胺黑（总蛋白）分析反应。**e（电子）**NLS相互作用PBD残基的突变阻止KD–PBD相互作用。实验如中所示一.（f）NLS相互作用PBD残基的突变增加Polo激酶活性。实验如中所示d日.克Polo活化与核定位耦合模型。详见正文。斑马鱼Polo的KD（绿色）和PBD（青色）与来自*果蝇属*Map205（红色）（蛋白质数据库登录号4J7B）用于PyMOL 1.4的结构渲染

图4
Polo的核活性在前期激活了Cdc25。一GFP-Cdc25在早期迅速从细胞核中排除。绿色方框表示NEB设置为之前在细胞质中首次检测GFP-Cdc25的时间吨 ₀酒吧：5 微米。在本实验中，用含有二甲基亚砜的培养基模拟处理细胞，作为补充图6b的对照。b条,**c（c）**GFP-Cdc25的核排除与Polo-RFP的核进口一致。酒吧：5 微米。(n个 = 10，误差条：SD）。d日如图所示，将细胞转染并用BI 2536处理，并通过western blots分析将其分为细胞质（C）和核（N）组分。Cdc25及其磷酸化形式的位置用箭头表示。MEK和组蛋白H3分别是作为对照的细胞质和核蛋白。**e（电子）**Cdc25磷酸化由细胞核中的Polo激酶调节。如图所示，暂时转染D-Mel2细胞。BI 2536添加到300 纳米。用蛋白质印迹法分析裂解产物。使用抗pY15抗体监测Cdk1的抑制磷酸化。**（f）**Polo促进细胞核中Cdc25的活化。用指示的构建物转染后，免疫沉淀Myc-CD25（WT或磷酸酶死亡）并在磷酸酶测定中进行测试。一个具有代表性的实验显示了重复读数。非盟任意单位。误差线：SD。克Polo和Cdc25之间的相互作用由Cdk1调节。用Myc-Cdc25和Polo-GFP（WT或NLS7A）质粒转染细胞，并用Cdk1抑制剂RO 3306（10 μM）。用抗GFP抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，并用指示的抗体进行免疫印迹

图5
Polo在前期未能定位到细胞核导致多发性有丝分裂缺陷。一在表达H2A-RFP的稳定细胞系中，诱导Polo-GFP（WT或所示突变体）的表达，并用Polo 3′UTR dsRNA（或对照dsRNA）转染细胞。第二天，用蛋白质印迹法分析蛋白质提取物*非特定波段。b条单元格来自一被拍摄下来。箭头显示滞后染色体。星号表示双核细胞中的细胞核。酒吧：5 微米。**c（c）**前期之间的时间（可见的染色体凝集开始，吨 ₀)并对后期进行了测量。d日分裂过程中带有滞后染色体的细胞的定量。**e（电子）**显示胞质分裂失败的细胞数量。**c（c）**–**e（电子）**在三个独立的实验中，每个条件下至少有40个细胞分裂被评分。误差线：SD(**P（P）* < 0.05; ***P（P）* < 0.01; ****P（P）* < 0.001; 学生的t吨测试；ns不显著）

图6
Polo活性和定位的协调对其体内功能至关重要。一使用无眼Gal4（eyGal4）驱动器诱导内源性Polo的同时耗竭，并在发育中的头部表达不同RNAi不敏感形式的Polo。从蛹病例中解剖出有蛹的成虫。显示了每个基因型的代表性图像。棒材：0.5 mm.交叉和PCR验证参见补充图7。b条RNAi不敏感型Polo-GFP（WT或突变体）拯救头部发育的能力，以存活率（蛹孵化）评分。在三个独立的实验中，百分比代表至少300只动物。误差线：SD。**c（c）**在内源性Polo存在下Polo-GFP（WT或突变体）过度表达后的成虫图像。棒材：0.5 毫米。d日在matα4-GAL-VP16驱动的转基因雌性生殖系中表达了不同形式的Polo-GFP。对这些雌性产卵的孵化胚胎的百分比进行评分。将三个独立实验的结果合并(n个 = 300). 误差线：SD(**P（P）* < 0.05; ***P（P）* < 0.01; ****P（P）* < 0.001; 学生的t吨测试）。**e（电子）**胚胎中Polo功能的增加导致有丝分裂MPM2表位的积累。从0–2中提取用westernblot检测h胚胎。**（f）**,克Polo功能的增加导致减数分裂和合胞体有丝分裂的发育缺陷。每2周收集一次表达不同形式Polo-GFP的雌性产下的卵子和胚胎免疫荧光法检测h和表型。固定后，GFP不可见。对于每个基因型，结果是从3到4个独立的收集汇编而成的。不同的类别是用颜色编码的。在一部分过度表达Polo-GFP变体的卵子/胚胎中，我们无法检测到明确的结构，这表明细胞核退化和/或在抗体接触不良的地方保持较深（灰色类别）。黄色箭头：后期缺陷。白色箭头：极体表示正常完成的减数分裂。黄色箭头：减数分裂纺锤体阻滞在中期I。比例尺：20 微米

图7
有丝分裂进入协调的时空模型。在G2/M转变时，活化的Polo转运到细胞核并磷酸化Cdc25。在Cdc25开始激活Cdk1（1）的前期，它开始重新定位到细胞质。在细胞核中，Cyclin B-Cdk1增强了Cdc25（2）的Polo-dependent重定位。这种正反馈机制加速了完全活性的细胞周期蛋白B-Cdk1（3）的生成，使染色体在有丝分裂进入时凝结和叶片解体

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1. Morgan，D.O.《细胞周期：控制原理》，297（新科学出版社，伦敦，2007年）。
1. Sunkel CE，Glover DM.Polo，果蝇有丝分裂突变体，显示异常纺锤极。J.细胞。科学。1988年；89:25–38.-公共医学
1. de Carcer G，Manning G，Malumbres M.从Plk1到Plk5：polo-like激酶的功能进化。细胞周期。2011;10:2255–2262. doi:10.4161/cc.10.14.16494。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Logarinho E，Sunkel CE。果蝇POLO激酶定位于有丝分裂器的多个隔室，是MPM2反应表位磷酸化所必需的。J.细胞。科学。1998;111:2897–2909.-公共医学
1. Zitouni S、Nabais C、Jana SC、Guerrero A、Bettencourt-Dias M.Polo-like激酶：结构变化导致多种功能。自然修订版分子细胞生物学。2014;15:433–452. doi:10.1038/nrm3819。-内政部-公共医学

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[1] Morgan，D.O.《细胞周期：控制原理》，297（新科学出版社，伦敦，2007年）。

[2] Morgan，D.O.《细胞周期：控制原理》，297（新科学出版社，伦敦，2007年）。

[3] Sunkel CE，Glover DM.Polo，果蝇有丝分裂突变体，显示异常纺锤极。J.细胞。科学。1988年；89:25–38.-公共医学

[4] Sunkel CE，Glover DM.Polo，果蝇有丝分裂突变体，显示异常纺锤极。J.细胞。科学。1988年；89:25–38.-公共医学

[5] de Carcer G，Manning G，Malumbres M.从Plk1到Plk5：polo-like激酶的功能进化。细胞周期。2011;10:2255–2262. doi:10.4161/cc.10.14.16494。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[6] de Carcer G，Manning G，Malumbres M.从Plk1到Plk5：polo-like激酶的功能进化。细胞周期。2011;10:2255–2262. doi:10.4161/cc.10.14.16494。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Logarinho E，Sunkel CE。果蝇POLO激酶定位于有丝分裂器的多个隔室，是MPM2反应表位磷酸化所必需的。J.细胞。科学。1998;111:2897–2909.-公共医学

[8] Logarinho E，Sunkel CE。果蝇POLO激酶定位于有丝分裂器的多个隔室，是MPM2反应表位磷酸化所必需的。J.细胞。科学。1998;111:2897–2909.-公共医学

[9] Zitouni S、Nabais C、Jana SC、Guerrero A、Bettencourt-Dias M.Polo-like激酶：结构变化导致多种功能。自然修订版分子细胞生物学。2014;15:433–452. doi:10.1038/nrm3819。-内政部-公共医学

[10] Zitouni S、Nabais C、Jana SC、Guerrero A、Bettencourt-Dias M.Polo-like激酶：结构变化导致多种功能。自然修订版分子细胞生物学。2014;15:433–452. doi:10.1038/nrm3819。-内政部-公共医学

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