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.2018年2月；175(3):440-455.
doi:10.1111/bph.14093。 Epub 2018年1月6日。

p62/SQSTM1在自噬之外的作用：从体外药物诱导毒性中吸取的教训

费尔南多·阿雷格里 1 2, 安格拉·B·莫拉格雷加 1, 米里亚姆·波罗 1 2, 阿尔贝托·马蒂·罗德里戈 1, Juan V Esplugues公司 1 2 3, 安娜·布拉斯·加西亚 1 3, 纳代兹达·阿波斯托洛娃 1 3
附属公司

p62/SQSTM1在自噬之外的作用：从体外药物诱导毒性中吸取的教训

费尔南多·阿雷格里等。 杂志. 2018年2月.

摘要

背景和目的：SQSTM1/p62是一种多功能、应激诱导的支架蛋白，参与多种细胞过程，包括自噬清除、炎症反应调节和氧化还原稳态。其功能改变与不同的人类病理学有关，如神经退行性疾病、代谢性疾病和骨疾病（下调）以及癌变（上调）。然而，其在临床使用药物的非靶向效应中的作用尚不清楚。

实验方法：我们评估了培养的Hep3B细胞及其衍生的ρ°细胞（缺乏线粒体）中p62的表达，以及自噬和线粒体功能障碍的标记。将依法韦伦的作用与已知的药理应激源鱼藤酮、他司加金和CCCP进行比较，我们还使用siRNA和p62过表达的短暂沉默。采用Western blotting、定量RT-PCR和荧光显微镜分析这些效应及其潜在机制。

主要成果：在Hep3B细胞中，依非韦伦增加了p62蛋白含量，在相应的ρ°细胞中没有观察到这种作用。p62上调是在通过转录因子CHOP/DDIT3介导的SQSTM1表达增强后发生的，而其他众所周知的调节因子（NF-kB和Nrf2）并未参与。用3MA或短暂沉默Atg5抑制自噬并不影响依法韦伦治疗的细胞中SQSTM1的表达，而p62的过度表达改善了依法韦伦对细胞存活的有害影响。

结论和启示：在我们的模型中，p62发挥了特异的、自噬无关的作用，并对依法韦伦诱导的线粒体ROS生成和NLRP3炎性体激活起到保护作用。这些发现增加了p62的多功能性，可能有助于了解临床有用药物的非靶向效应。

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数字

图1
图1
暴露于线粒体和内质网应激刺激后，p62的表达在蛋白质和mRNA水平上增加。将细胞处理24 h（A、C、D、E和F）或4、8、24和48 h（B），并增加依法韦伦（EFV）、载体（MeOH或DMSO）、thapsigargin（Tg）2μM、鱼藤酮（Rot）25μM或CCCP 10μM的浓度。用看家蛋白（β-actin或GAPDH）或基因表达归一化后，数据（平均值±SEM）表示为相对于未处理细胞（对照，视为100%）的相对蛋白质或mRNA含量(ACTB公司). （A） 全细胞提取物的免疫印迹分析显示典型的Western印迹图像和p62表达的密度测定数据摘要(n个=9，EFV50和鱼藤酮除外n个=8，CCCP，n个=7，萨普西加金，n个 = 6). （B） 总细胞提取物的时间历程免疫印迹分析显示了代表性的Western印迹图像和密度测定数据，这些数据表达了指定治疗时间内p62蛋白水平的定量(n个 = 7). p62在未经处理的细胞（在所有时间点）中的表达被认为是100%。（C） 总细胞提取物的免疫印迹分析显示p62的代表性Western印迹图像和ρ密度测定数据摘要+和ρ°细胞(n个 = 6). 未经处理的野生型（ρ+)细胞被认为是100%（左面板），而未经治疗的p62表达（ρ+和ρ°；显示为Rho）的细胞被视为1（右侧面板）。（D） 相对mRNA表达水平SQSTM1系列Hep3B细胞中(n个=8，DMSO、thapsigargin、鱼藤酮和CCCP除外n个=5）和（E）人类肝细胞(n个=2）进行定量RT-PCR分析。数据与看家基因β‐肌动蛋白进行了标准化(ACTB公司). （F） 总细胞提取物的免疫印迹分析显示了p62的代表性Western印迹图像，并总结了与依法韦伦和放线菌素D（2μg·mL）共同处理的细胞的密度测定数据−1)（基因转录抑制剂）(n个=7，EFV10和EFV25除外，n个 = 5). 数据（平均值±SEM）以对照组（未处理细胞）的百分比计算*P（P）埃法韦伦茨<0.05#P（P）thapsigargin、鱼藤酮、CCCP均<0.05；与车辆显著不同；单因素方差分析，然后进行纽曼-凯尔斯检验+P（P）<0.05，与所示差异显著；学生的t吨‐测试。
图2
图2
p62的差异亚细胞表达。p62的代表性Western blot图像（A）和从Hep3B细胞获得的线粒体富集提取物和细胞溶质提取物中的密度测定数据汇总（B，C），这些提取物是通过增加浓度的依法韦伦（EFV）、载体（MeOH或DMSO）、thapsigargin（Tg）2μM、鱼藤酮（Rot）处理的在有或无2μg·mL的情况下，25μM或CCCP 10μM持续24小时−1放线菌素D(n个 = 5). 从线粒体和细胞溶质蛋白提取物中装载等量的蛋白质（30μg）。评估肌动蛋白和孔蛋白的表达，以确保提取物的纯度。数据（平均值±SEM）以对照组的百分比计算（两种提取物中未处理的细胞被视为100%）*P（P）<0.05，对于efavirenz和#P（P）thapsigargin、鱼藤酮或CCCP均<0.05，与载体显著不同；单因素方差分析，然后进行纽曼-凯尔斯检验+P（P）<0.05，与所示差异显著；双向方差分析，然后进行Sidak检验。（D） 用Veh或EFV（10、25或50μM）处理的细胞的典型共焦荧光显微镜图像（63×3.0数码变焦），并对p62（红色）和线粒体（TOM20，绿色）进行免疫染色。细胞核用荧光染料Hoechst（蓝色）染色。箭头表示同位化点。（E） p62荧光信号的定量表示为%。
图3
图3
p62表达依赖于钙和CHOP。在存在或不存在自噬抑制剂bafilomycin A1 20 nM的情况下，用浓度增加的依法韦伦（EFV）、载体（MeOH）、thapsigargin（Tg）2μM或鱼藤酮（Rot）25μM处理Hep3B细胞24 h。（A） 相对信使核糖核酸表达水平SQSTM1系列在钙存在或不存在的情况下2+螯合剂BAPTA‐AM（10μM）通过定量RT-PCR进行分析。数据与看家基因β‐肌动蛋白进行了标准化(ACTB公司)和SQSTM1系列未经处理的细胞（不含BAPTA‐AM）中的表达被认为是100%（平均值±SEM，n个 = 5). （B） p62、LC3和CHOP的代表性WB图像，以及转染siControl或si的细胞的密度测定数据摘要印章数据（平均值±SEM，n个=5）计算为未处理siControl细胞的百分比（视为100%）*P（P）<0.05，对于efavirenz和#P（P）thapsigargin、鱼藤酮或CCCP均<0.05，与载体显著不同；单因素方差分析，然后进行纽曼-凯尔斯检验+P（P）<0.05，与所示差异显著；学生的t吨测试。（C） CHOP与SQSTM1系列启动子存在efavirenz，但不存在Nrf2或NF‐κB。在用依法韦仑（25μM）处理的Hep3B细胞中进行染色质免疫沉淀（ChIP）分析后，PCR条带的代表性图像，其中染色质用抗-Nrf2免疫沉淀，抗NF‐κB或抗CHOP抗体和PCR检测，以扩增免疫沉淀染色质，引物位于Nrf2、NF‐）κB和CHOP的结合位点两侧SQSTM1系列启动子（左侧面板）；ChIP分析的代表性图像显示SQSTM1系列CHOP在用载体和依法韦伦茨（10和25μM）处理的Hep3B细胞中的启动子占有率（右侧面板）。非相关抗体抗IgG和输入对照分别用作阴性和阳性对照。
图4
图4
p62上调独立于自噬发生。用载体（MeOH）、EFV（10或25μM）、Tg 2μM或自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3MA）2.5 mM处理Hep3B细胞24小时。（A） 在瞬时转染siControl或si的细胞中β‐肌动蛋白表达正常化后，LC3的典型Western blot图像和密度测定数据摘要SQSTM1系列其中LC3‐II在未经处理的siControl细胞中的表达被认为是100%。p62的缺失证实了SQSTM1系列沉默。（B） 相对信使核糖核酸水平SQSTM1系列在缺乏或存在2.5 mM 3MA的情况下，通过定量RT-PCR进行分析，并与看家基因β-Actin进行归一化(ACTB公司). （C） 相对mRNA水平SQSTM1系列，在siControl和si中自动液位计5通过定量RT-PCR分析细胞，并与看家基因β-肌动蛋白进行标准化(ACTB公司). 数据（平均值±SEM，n个＝5）计算为对照（未处理的细胞）的百分比*P（P）<0.05，对于efavirenz和#P（P）thapsigargin组<0.05，与载体组差异显著；单因素方差分析，然后进行纽曼-凯尔斯检验。不另作说明，siRNA或3MA无显著影响；学生的t吨‐测试。（D） ●●●●。的表达式ATG5型为了验证它的沉默，我们用Western blotting（代表性图像）进行了研究，并以GAPDH的表达作为参考。
图5
图5
SQSTM1系列沉默增强了依法韦伦诱导的线粒体功能障碍和炎症反应，但不增强UPR。瞬时转染siControl或SQSTM1系列在没有或存在自噬抑制剂3MA的情况下，用增加浓度的依法韦伦（EFV）、溶媒、thapsigargin（Tg）2μM、鱼藤酮（Rot）25μM或CCCP 10μM治疗24 h。（A） p62、CHOP和GRP78的代表性Western blot图像和密度测定数据总结(n个 = 5). p62的缺失证实了SQSTM1系列沉默。（B） ΔΨ的定量分析米（四甲基罗丹明甲酯荧光）和线粒体超氧化物产生（MitoSOX荧光）(n个 = 7). （C） 通过活细胞荧光显微镜和静态细胞术定量分析细胞数量（Hoechst荧光）和线粒体超氧化物生成（MitoSOX荧光）。（D） 通过定量RT-PCR分析炎症相关基因的相对mRNA表达水平(n个 = 5). 数据（平均值±SEM）以对照组（未经处理的SiControl细胞）的百分比计算*P（P）<0.05，对于efavirenz和#P（P）对thapsigargin、鱼藤酮或CCCP<0.05，与载体显著不同；单因素方差分析，然后进行纽曼-凯尔斯检验+P（P）<0.05，与所示差异显著；学生的t吨‐测试。
图6
图6
p62过表达对细胞活性具有保护作用。用对照质粒瞬时转染Hep3B细胞或平方毫米1用增加浓度的EFV、溶媒或thapsigargin（Tg）2μM处理樱桃24小时。The efficacy ofSQSTM1系列WB（A）证实过表达。通过活细胞荧光显微镜和静态细胞术（B）定量分析细胞数量（Hoechst荧光）。数据（平均值±SEM）以对照组（未经处理的对照细胞）的百分比计算*P（P）<0.05，对于依非韦伦和#P（P）thapsigargin组<0.05，与载体组差异显著；单因素方差分析，然后进行纽曼-凯尔斯检验+P（P）<0.05，与所示差异显著；学生的t吨‐测试。
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