Cysteine Dioxygenase 1 Mediates Erastin-Induced Ferroptosis in Human Gastric Cancer Cells

doi:10.1016/j.neo.2017.10.005

.2017年12月；19(12):1022-1032.

doi:10.1016/j.neo.2017.10.005。 Epub 2017年11月13日。

半胱氨酸双加氧酶1介导Erastin诱导的人胃癌细胞铁凋亡

郝世辉¹, 姜瑜², 万明河¹, 琼黄（音）¹, 杨钊¹, 梁碧山¹, 张淑怡¹, 赵伟文¹, 董淑敏¹, 饶进军（Jinjun Rao）^三, 廖望军¹, 闵石⁴

附属公司

¹南方医科大学南方医院肿瘤科，广东省广州市，邮编510515。
²中国广东省广州市南方医科大学南方医院普外科，邮编510515。
^三广东省新药筛选重点实验室，南方医科大学药学学院，广州，广东510515，中国。
⁴中国广东省广州市南方医科大学南方医院肿瘤科，邮编510515。电子地址：nfyyshimin@163.com。

PMID： 29144989
预防性维修识别码：项目经理5686465
内政部： 2016年10月10日/j.neo.2017.10.005

半胱氨酸双加氧酶1介导Erastin诱导的人胃癌细胞铁凋亡

郝世辉等。肿瘤形成. 2017年12月.

.2017年12月；19(12):1022-1032.

doi:10.1016/j.neo.2017.10.005。 Epub 2017年11月13日。

作者

郝世辉¹, 姜瑜², 万明河¹, 琼黄（音）¹, 杨钊¹, 梁碧山¹, 张淑怡¹, 赵伟文¹, 董树民¹, 饶进军（Jinjun Rao）^三, 廖望军¹, 闵石⁴

附属公司

¹南方医科大学南方医院肿瘤科，广东省广州市，邮编510515。
²中国广东省广州市南方医科大学南方医院普外科，邮编510515。
^三广东省新药筛选重点实验室，南方医科大学药学学院，广州，广东510515，中国。
⁴中国广东省广州市南方医科大学南方医院肿瘤科，邮编510515。电子地址：nfyyshimin@163.com。

PMID： 29144989
预防性维修识别码：项目经理5686465
内政部： 2016年10月10日/j.neo.2017.10.005

摘要

背景：铁下垂是最近发现的一种铁依赖性非凋亡细胞死亡形式。其特征是脂质修复酶谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）活性的丧失，以及致命的活性脂质氧物质的积累。然而，我们对胃癌细胞中的铁下垂及其分子机制仍知之甚少。在这里，我们证明了橡皮素，一种经典的铁下垂诱导剂，在GC细胞中诱导这种形式的细胞死亡，并且半胱氨酸双加氧酶1（CDO1）在这一过程中起着重要作用。

方法：我们进行了定量实时聚合酶链反应、Western blotting、细胞活性测定、活性氧（ROS）测定、谷胱甘肽测定、脂质过氧化测定、RNAi和基因转染、免疫荧光染色、双核糖核酸酶报告物测定、透射电镜、，染色质免疫沉淀法研究GC细胞中的铁下垂调节。采用小鼠异种移植物实验来研究其体内机制。

结果：沉默CDO1可在体内外抑制橡皮素诱导的GC细胞的铁凋亡。抑制CDO1可恢复细胞GSH水平，阻止ROS生成，并减少脂质过氧化的最终产物之一丙二醛。此外，沉默COO1可以维持经橡皮素处理的细胞线粒体形态的稳定性。从机制上讲，c-Myb转录调节CDO1，抑制CDO1表达上调GPX4表达。

结论：我们的发现使我们更好地了解了GC细胞中的铁下垂及其分子机制，从而深入了解了铁下垂介导的癌症治疗。

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数字

图1
CDO1抑制有助于抵抗铁凋亡。（A）用0、2.5、5、10、15、20或40μg/ml橡皮素处理GC细胞24小时。用MTT法测定细胞活力。（B）通过qRT-PCR评估GC细胞中GPX4、溶质载体家族7成员11（Slc7a11）和CDO1的表达。（C）用橡皮素（E，10μg/ml）处理GC细胞，并使用或不使用Z-VAD-FMK（凋亡抑制剂）、坏死抑素（坏死抑素）、3-甲基腺嘌呤（3-MA，自噬抑制剂）和铁抑素-1或脂质抑素-1（铁凋亡抑制剂）处理24小时。用MTT法测定细胞活力。（D）用或不用橡皮素（10μg/ml）处理GC细胞。检测LDH释放试验。（E） siRNA序列[CDO1 siRNA（2）和（3）]设计用于沉默CDO1。用qRT-PCR检测GC细胞CDO1 mRNA水平。（F） siRNA序列[CDO1 siRNA（2）和（3）]设计用于沉默CDO1。Western blotting检测GC细胞CDO1蛋白水平。（G）用橡皮素（0、2.5、5、10、15和20μG/ml）处理CDO1 siRNA（2）-和CDO1 siRNA（3）-沉默的GC细胞24小时，并用MTT法测定细胞活力。定量数据以三个独立实验的平均值±SD表示。^⁎*P（P）* < .05,^在*P（P）* < .01,^⁎⁎⁎*P（P）* < .001.

图2
CDO1调节脱铁性贫血生物标志物。用10μg/ml橡皮素处理CDO1沉默的GC细胞24小时。（A）测定GSH、（B）ROS和（C）MDA水平。用10μg/ml橡皮素处理CDO1 siRNA-silenced GC细胞24小时。通过qRT-PCR（D）、Western blotting（E）和免疫荧光（F）评估GPX4的表达。（G）用10μG/ml erastin处理24小时的CDO1 siRNA（2）和CDO1 siRNA（3）沉默的AGS细胞的透射电子显微镜图像。左，1×10⁴放大倍数，比例尺=2μm；右侧，5×10⁴放大倍数，比例尺=500 nm。定量数据以三个独立实验的平均值±SD表示。^⁎*P（P）* < .05,^⁎⁎*P（P）* < .01,^⁎⁎⁎*P（P）* < .001.

图3
C-Myb调节细胞凋亡过程中CDO1的表达。（A）用橡皮素（10或30μg/ml）处理GC细胞24小时。通过Western blotting检测CDO1、c-Myb和GPX4蛋白的表达水平。（B） siRNA序列[c-Myb siRNA（1）、（2）和（3）]用于沉默c-Myb。用qRT-PCR检测GC细胞中c-Myb的mRNA水平。（C） siRNA序列[C-Myb siRNA（1）、（2）和（3）]用于沉默C-Myb。Western blotting检测GC细胞中c-Myb的蛋白水平。（D）转染三种不同的c-Myb siRNA序列以沉默c-Myb表达后，通过MTT法测定细胞活性。（E）用橡皮素（5、10或20μg/ml）处理c-Myb沉默的GC细胞24小时，用MTT法检测细胞活力。C-Myb过度表达，CDO1和GPX4的（F）mRNA和（G）蛋白表达水平分别通过qRT-PCR和Western blotting检测（V，载体；M，过度表达）。（H）当c-Myb过度表达时，检测GPX4的免疫荧光染色。（I）在用erastin（10μg/ml）处理的GC细胞中，c-Myb过表达或CDO1抑制表达后，通过MTT法测定细胞活力。（J） CDO1和c-Myb之间的相互作用通过荧光素酶报告试验进行了验证。（K）染色质免疫沉淀分析显示c-Myb与CDO1启动子有三个阳性结合位点。定量数据以三个独立实验的平均值±SD表示。^⁎*P（P）* < .05,^⁎⁎*P（P）* < .01,^⁎⁎⁎*P（P）*<.001。

图4
抑制CDO1抑制铁凋亡体内（A）裸鼠皮下注射BGC823细胞（1×10⁶细胞/小鼠），从第10天开始用橡皮素（20mg/kg，腹腔注射，每隔一天两次）治疗4周。每5天计算肿瘤体积（n=5）。（B，C）切除裸鼠的肺、肝、脾、肾、心脏和移植皮下肿瘤，并用苏木精-伊红染色。放大倍数：100×（左面板），比例尺=100μm；400×（右侧面板），比例尺=25μm。采用免疫组织化学方法检测裸鼠皮下肿瘤中CDO1、GPX4和PTGS2（E）的表达。放大倍数：100×（左面板）；比例尺=100μm；200×（右面板），比例尺=50μm；400×（右侧面板），比例尺=25μm。

图5
图总结了CDO1在橡皮素诱导的铁凋亡中的作用。伊拉斯汀通过抑制系统X抑制细胞半胱氨酸摄取_C类⁻和消耗谷胱甘肽。这导致GPX4失活，ROS增加，随后发生铁凋亡。由c-Myb转录调控的CDO1可以将半胱氨酸转化为牛磺酸，从而竞争性地剥夺细胞合成谷胱甘肽所用的半胱氨酸。当CDO1表达受到抑制时，半胱氨酸向牛磺酸的转化降低，促进GSH的生成。因此，GPX4活性被促进，抑制ROS积累和脂质过氧化，最终降低铁沉积的风险。

**补充图1**
CDO1在胃癌和正常胃组织中的表达。（A） 16对患者标本（C，癌症；N，正常）的CDO1 mRNA表达水平。（B）四对患者标本（C，癌症；N，正常）的CDO1蛋白表达水平。（C）用5、10或20μg/ml橡皮素处理24小时后过度表达CDO1的GC细胞的存活率（V，载体；M，过度表达）。定量数据以三个独立实验的平均值±SD表示。^⁎*P（P）*＜0.05，^⁎⁎*P（P）* < .01,^⁎⁎⁎*P（P）* < .001.

**补充图2**
通过CDO1改变GPX4 mRNA水平。用10μg/ml橡皮素处理过表达CDO1-GC细胞24小时（V，载体；M，过表达）。定量数据以三个独立实验的平均值±SD表示。^⁎*P（P）* < .05,^⁎⁎*P（P）* < .01,^⁎⁎⁎*P（P）* < .001.

**补充图3**
肿瘤中Ki-67的免疫组织化学。免疫组织化学法检测Ki-67在裸鼠皮下肿瘤中的表达。放大倍数：100×（左面板）；比例尺=100μm；200×（右面板），比例尺=50μm；400×（右侧面板），比例尺=25μm。

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