Yes-Associated Protein (YAP) Promotes Tumorigenesis in Melanoma Cells Through Stimulation of Low-Density Lipoprotein Receptor-Related Protein 1 (LRP1)

doi:10.1038/s41598-017-14764-4

.2017年11月14日；7(1):15528.

doi:10.1038/s41598-017-14764-4。

Yes-Associated Protein（YAP）通过刺激低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）促进黑色素瘤细胞的肿瘤发生

熊惠子^1 2, 钱瑜¹, 愚公¹, 陈文娟¹, Yunlei Tong先生¹, 姚旺¹, 许慧（音）¹, 石玉玲³

附属公司

¹同济大学医学院上海第十人民医院皮肤科，上海，200072。
²江南大学附属医院皮肤科，江苏无锡，214062。
³同济大学医学院上海第十人民医院皮肤科，上海，200072。shiyuling1973@tongji.edu.cn。

PMID： 29138479
预防性维修识别码：项目编号：5686191
内政部： 10.1038/s41598-017-14764-4

Yes-Associated Protein（YAP）通过刺激低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）促进黑色素瘤细胞的肿瘤发生

熊惠子等。科学代表. 2017.

.2017年11月14日；7(1):15528.

doi:10.1038/s41598-017-14764-4。

作者

熊惠子^1 2, 钱瑜¹, 愚公¹, 陈文娟¹, Yunlei Tong先生¹, 姚旺¹, 许慧（音）¹, 石玉玲³

附属公司

¹同济大学医学院上海第十人民医院皮肤科，上海，200072。
²江南大学附属医院皮肤科，江苏无锡，214062。
³同济大学医学院上海第十人民医院皮肤科，上海，200072。shiyuling1973@tongji.edu.cn。

PMID： 29138479
预防性维修识别码：项目编号：5686191
内政部： 10.1038/s41598-017-14764-4

摘要

YAP是癌症发展中的一种关键蛋白，可以诱导乳腺上皮细胞的转化表型。以前的研究已经提供了证据，证明YAP可以促进黑色素瘤的转移行为，因为YAP的特异性敲除会降低体外转移和侵袭能力。然而，YAP调节黑色素瘤功能的机制尚不清楚。在这里，我们发现YAP对LRP1的表达有积极影响，LRP1在癌症中也起着关键作用。从机制上讲，敲除YAP导致LRP1在蛋白质和mRNA水平上显著下调。组织芯片分析（TMA）也显示了YAP和LRP1表达之间的正相关。此外，通过同时过度表达LRP1，可以部分逆转YAP受损的致癌前表型的减少，这表明LRP1在YAP诱导的黑色素瘤发生中具有重要功能。此外，我们发现LRP1通过转录和启动子依赖机制被YAP调节。总之，我们的结果表明，YAP通过刺激LRP1启动子调节LRP1，LRP1可能是影响黑色素瘤中YAP的重要靶点。

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作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
YAP和LRP1在促进黑色素瘤A375细胞转化表型中的作用。(一,b条)用MTT法检测YAP-sh质粒或LRP1-sh质粒感染黑色素瘤A375细胞后的细胞增殖情况。MTT分析的初始细胞数为5000，“GFP-sh”组的数据被任意设置为100%。(**c（c）**,d日)用Promega的Caspase-Glo 3/7检测试剂盒检测YAP-sh质粒或LRP1-sh质粒感染下黑色素瘤细胞的Caspase 3/7活性。(**e（电子）**)免疫荧光法检测到，YAP和LRP1降低了感染YAP-sh质粒或LRP1-sh质粒的A375细胞中Caspase 3表达24小时 h.比例尺.μm。(**（f）**,克)采用跨阱法评估YAP-sh质粒或LRP1-sh质粒感染黑色素瘤A375细胞的细胞增殖。transwell分析的初始细胞数为5000，“GFP-sh”组的数据被任意设置为100%。(小时)分别用MTT法检测YAP-FLAG质粒或LRP1-FLAG质粒转染后黑色素瘤A375细胞的增殖情况。(我)如图所示，在YAP-FLAG质粒或LRP1-FLAG质粒转染下，通过来自Promega的Caspase-Glo 3/7测定试剂盒测量黑色素瘤细胞的Caspase 3/7活性。(j个,k个)用MTT法评估转染YAP-FLAG质粒或LRP1-FLAG质粒后黑色素瘤A375细胞的增殖情况。数据显示为平均值 ± 来自三个独立实验（包括WB）的SD*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001与学生测量的对照t吨测试。

图2
YAP和LRP1在促进黑色素瘤MUM-2B细胞转化表型中的作用。(一,b条)分别用MTT法检测YAP-sh质粒或LRP1-sh质粒感染后黑色素瘤MUM-2B细胞的增殖情况。MTT分析的初始细胞数为5000，“GFP-sh”组的数据被任意设置为100%。(**c（c）**,d日)用Promega的Caspase-Glo 3/7检测试剂盒检测YAP-sh质粒或LRP1-sh质粒感染下黑色素瘤细胞的Caspase 3/7活性。(**e（电子）**)免疫荧光法检测到，YAP和LRP1降低了感染YAP-sh质粒或LRP1-sh质粒的MUM-2B细胞中Caspase 3表达24小时 h.比例尺.μm。(**（f）**,克)采用跨阱法评估YAP-sh质粒或LRP1-sh质粒感染下黑色素瘤MUM-2B细胞的增殖情况。transwell分析的初始细胞数为5000，“GFP-sh”组的数据被任意设置为100%。(小时)用MTT法评估转染YAP-FLAG质粒或LRP1-FLAG质粒后黑色素瘤MUM-2B细胞的增殖情况。(我)用Promega的Caspase-Glo 3/7检测试剂盒检测转染YAP-FLAG质粒或LRP1-FLAG质粒后黑色素瘤细胞的Caspase 3/7活性。(j个,k个)使用转染YAP-FLAG质粒或LRP1-FLAG质粒的黑色素瘤MUM-2B细胞的细胞增殖情况，如所示。数据显示为平均值 ± SD来自三个独立实验*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001与学生测量的对照t吨测试。

图3
组织芯片标本中YAP和LRP1的一致性。(一,b条)TMA载玻片包括40个皮肤黑色素瘤组织和8个位于每个TMA底部的皮肤正常组织。用抗YAP或抗LRP1抗体染色的HCC TMA的IHC代表性图像。比例尺，100 微米。(**c（c）**)用抗YAP或抗LRP1抗体染色的皮肤黑色素瘤HCC TMA的IHC代表性图像。比例尺，100 微米。(d日)抗YAP或抗LRP1抗体染色的HCC TMA皮肤黑色素瘤IHC图像的统计数字。TMA数据采用χ2检验进行分析。

图4
YAP促进的LRP1依赖于A375细胞中的转录。(一,b条)感染GFP-sh或LRP1-sh1或LRP1-sh2的黑色素瘤A375细胞中LRP1的蛋白印迹(一); 相对LRP1蛋白水平显示为LRP1和GAPDH的比值，感染GFP-sh的A375细胞的蛋白水平被任意设置为100%(b条). (**c（c）**,d日)转染GFP-sh或YAP-FLAG的黑色素瘤A375细胞中YAP的Western blot(**c（c）**); 相对LRP1蛋白水平显示为YAP和GAPDH之间的比率，感染GFP-sh的黑色素瘤A375细胞的蛋白水平被任意设置为100%(d日). (**e（电子）**,**（f）**)转染GFP-sh或LRP1-FLAG的黑色素瘤A375细胞中LRP1的蛋白印迹(**e（电子）**); 相对LRP1蛋白水平显示为LRP1和GAPDH的比值，感染GFP-sh的A375细胞的蛋白水平被任意设置为100%(**（f）**). (克,小时)感染GFP-sh、YAP-sh1或YAP-sh2的黑色素瘤A375细胞中LRP1的蛋白质印迹(克); 相对LRP1蛋白水平显示为LRP1和GAPDH之间的比率，并且用GFP-sh感染的A375细胞的蛋白水平任意设置为100%(小时). (我)加入CHX（50 μg/ml）。并且LRP1蛋白被标准化为GAPDH蛋白。0 h时间点被任意设置为100%（下面板）。(j个)CHX后时间依赖性Caspase 3/7活性（50 μg/ml）。蓝线代表对照组；红线代表YAP-FLAG组。(k个)CHX后时间依赖性Caspase 3/7活性（50 μg/ml）。蓝线代表对照组；红线代表YAP-FLAG组。(我)GFP-sh、YAP-sh1或YAP-sh2感染的黑色素瘤A375细胞中LRP1的相对mRNA(米,n个)使用抗YAP和抗LRP1抗体进行免疫荧光分析（下面板）。比例尺，10 微米。(**o（o）**,第页)敲除YAP抑制LRP1启动子的活性，过表达YAP刺激LRP1的活性，LRP1基因启动子含有−2000 bp至+150 在具有转染PGL4/Basic的对照的黑色素瘤A375细胞中测量bp萤光素酶活性。数据显示为平均值 ± SD来自三个独立实验（包括WB）*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001与学生测量的对照t吨测试。

图5
YAP促进的LRP1依赖于MUM-2B细胞中的转录。(一,b条)感染GFP-sh或LRP1-sh1或LRP1-sh2的黑色素瘤MUM-2B细胞中LRP1的蛋白印迹(一); 相对LRP1蛋白水平显示为LRP1和GAPDH之间的比率，感染GFP-sh的MUM-2B细胞的蛋白水平被任意设置为100%(b条). (**c（c）**,d日)转染GFP-sh或YAP-FLAG的黑色素瘤MUM-2B细胞中YAP的Western blot(**c（c）**); 相对LRP1蛋白水平显示为YAP和GAPDH之间的比率，感染GFP-sh的黑色素瘤MUM-2B细胞的蛋白水平被任意设置为100%(d日). (**e（电子）**,**（f）**)转染GFP-sh或LRP1-FLAG的黑色素瘤MUM-2B细胞中LRP1的蛋白印迹(**e（电子）**); 相对LRP1蛋白水平显示为LRP1和GAPDH之间的比率，感染GFP-sh的MUM-2B细胞的蛋白水平被任意设置为100%(**（f）**). (克,小时)感染GFP-sh、YAP-sh1或YAP-sh2的黑色素瘤MUM-2B细胞中LRP1的蛋白印迹(克); 相对LRP1蛋白水平显示为LRP1和GAPDH之间的比率，感染GFP-sh的MUM-2B细胞的蛋白水平被任意设置为100%(小时). (我)用空质粒或YAP-FLAG质粒转染黑色素瘤MUM-2B细胞，加入CHX（50 μg/ml）。LRP1蛋白归一化为GAPDH蛋白。0 h时间点被任意设置为100%（下面板）。(j个)CHX后时间依赖性胱天蛋白酶3/7活性（50 μg/ml）。蓝线代表对照组；红线代表YAP-FLAG组。(k个)CHX后时间依赖性Caspase 3/7活性（50 μg/ml）。蓝线代表对照组；红线代表YAP-FLAG组。(我)感染GFP-sh、YAP-sh1或YAP-sh2的黑色素瘤MUM-2B细胞中LRP1的相对mRNA。(米,n个)使用抗YAP和抗LRP1抗体进行免疫荧光分析（下面板）。比例尺，10 微米。(**o（o）**,第页)敲除YAP抑制LRP1启动子的活性，过表达YAP刺激LRP1的活性，LRP1基因启动子含有−2000 bp至+150 检测转染PGL4/Basic的对照组黑色素瘤MUM-2B细胞的bp荧光素酶活性。数据显示为平均值 ± SD来自三个独立实验（包括WB）*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001与学生测量的对照t吨测试。

图6
LRP1用YAP-KD逆转黑色素瘤细胞中受损的促癌功能。(一)如图所示，用不同表达质粒转染黑色素瘤A375细胞后，通过MTT检测细胞增殖。(b条)当转染不同表达质粒时，测量黑色素瘤A375细胞中Caspase 3/7的活性。(**c（c）**,d日)当转染不同表达质粒时，通过Transwell分析测定黑色素瘤A375细胞的Transwell-活性。(**e（电子）**)如图所示，用不同表达质粒转染黑色素瘤MUM-2B细胞后，通过MTT检测细胞增殖。(**（f）**)当转染不同表达质粒时，测量黑色素瘤MUM-2B细胞中Caspase 3/7的活性。(克,小时)当转染不同表达质粒时，通过Transwell分析测定黑色素瘤MUM-2B细胞的Transwell活性。数据显示为平均值 ± SD来自三个独立实验*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01与学生测量的对照t吨测试。

图8
YAP通过促进黑色素瘤细胞的增殖和转移以及减少凋亡来调节LRP1的可能机制。这些途径涉及肿瘤发生和进展的几个过程。Yes-associated Protein（YAP）可通过与LRP1受体结合刺激低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）的表达。LRP1可激活有丝分裂原激活的蛋白激酶信号通路（MAPK），从而提高基质金属蛋白酶（MMP）2和MMP9的转录水平。MMP2/9可促进癌细胞增殖和侵袭。LRP1激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT）信号通路和胰岛素受体（IR），抑制癌细胞凋亡。

图7
LRP1逆转了*活泼地*采用YAP-KD。(一)A375黑色素瘤细胞和MUM-2B黑色素瘤细胞（2 × 10⁵)转染GFP-sh、YAP-sh或YAP-sh + LRP1-FLAG，然后皮下注射给裸鼠（n = 每组5个）。三周后，处死每组小鼠队列，以确定肿瘤体积、体内重复实验两次. (b条)皮下注射稳定转染YAP-sh质粒或感染YAP-sh的A375黑色素瘤细胞形成的异种移植瘤的表示（向上）和量化（向下） + LRP1-FLAG质粒。(**c（c）**)皮下注射稳定转染YAP-sh质粒或感染YAP-sh的MUM-2B黑色素瘤细胞形成的异种移植瘤的表示（向上）和量化（向下） + LRP1质粒*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001与学生测量的对照t吨测试。

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[2] Bonin S等人，对以过度阳光照射为特征的人群进行20年观察，发现皮肤黑色素瘤的频率和季节性趋势。放射学和肿瘤学。2015;49:379–385. doi:10.1515/raon-2015-0039。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[3] Whiteman DC等。解剖部位、阳光照射和皮肤黑色素瘤风险。临床肿瘤学杂志：美国临床肿瘤学会官方杂志。2006;24:3172–3177. doi:10.1200/JCO.2006.06.1325。-内政部-公共医学

[4] Whiteman DC等。解剖部位、阳光照射和皮肤黑色素瘤风险。临床肿瘤学杂志：美国临床肿瘤学会官方杂志。2006;24:3172–3177. doi:10.1200/JCO.2006.06.1325。-内政部-公共医学

[5] Leucci E，Coe EA，Marine JC，Vance KW。长非编码RNA在皮肤黑色素瘤中的新作用。色素细胞和黑色素瘤研究。2016;29:619–626. doi:10.1111/pcmr.12537。-内政部-公共医学

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