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.2017年9月15日；8(48):84285-84299.
doi:10.18632/目标20894。 eCollection 2017年10月13日。

钠的β3亚基的表达+/K（K）+-胃癌中ATP酶增加，并通过PI3/AKT途径调节胃癌细胞的进展和预后

李丽 # 1, 如峰 # 2, 钱旭 2, 张飞跃 2, 刘彤（音译） 2, 江曹 三, 苏娟飞 1
附属公司

钠的β3亚基的表达+/K（K）+-胃癌中ATP酶增加，并通过PI3/AKT途径调节胃癌细胞的进展和预后

李丽等。 肿瘤靶点. .

摘要

ATP1B3编码Na的β3亚单位+/K（K）+-ATP酶，位于3号染色体的q22-23区域。纳+/K（K）+-ATP酶参与正常的细胞活动，但在致癌过程中也起着关键作用。在本研究中，我们发现Na的β3亚单位的表达+/K（K）+-与正常匹配组织相比，人胃癌组织中的ATP酶增加，这种增加的表达预示着不良结果。与正常胃上皮细胞系相比，胃癌细胞系中ATP1B3的mRNA和蛋白水平均升高。有趣的是，ATP1B3敲低显著抑制人胃癌细胞系的细胞增殖、克隆形成能力、迁移和侵袭，并增加细胞凋亡。此外，敲除诱导细胞周期阻滞在G2/M期。此外，我们证明ATP1B3沉默可降低磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）和磷酸化AKT（p-AKT）的表达，表明ATP1B3通过PI3K/AKT信号通路调节胃癌细胞的进展。因此，Na的β3亚单位+/K（K）+-ATP酶在胃癌的发生中起着重要作用，可能是胃癌治疗的潜在预后和治疗靶点。

关键词：ATP1B3；细胞凋亡；胃癌；迁移；增殖。

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数字

图1
图1。人类胃癌组织中ATP1B3表达增加
负片的代表性图像（A）和积极的（B）ATP1B3在邻近正常组织中的表达。比例尺，100μm。负片的代表性图像（C）和积极的（D）胃癌组织中ATP1B3的表达。比例尺，100μm。（E）ATP1B3表达与胃癌预后的关系。胃癌患者总生存率的Kaplan-Meier曲线。ATP1B3阳性表达胃癌患者的总生存率显著低于阴性表达胃癌患者（n=30，P=0.041）。因此，这些结果表明，ATP1B3是增加的非人类胃癌，并预测不良预后。
图2
图2。胃癌细胞株ATP1B3 mRNA和蛋白水平
（A）RT-PCR检测胃癌细胞株ATP1B3 mRNA表达水平。RT-PCR结果显示，ATP1B3在分化程度不同的胃癌细胞和GES-1细胞中均有表达。（B）Western blot检测胃癌细胞株ATP1B3蛋白表达水平。GAPDH作为内源性对照。M： 标记。与正常胃上皮细胞相比，胃癌细胞中ATP1B3蛋白表达增加。（C）相对积分密度值表示为平均值±SD。结果代表了三个独立的实验。基于平均值，ATP1B3在SGC-7901和MMKN-45细胞中的表达水平较高。
图3
图3。通过转染ATP1B3-siRNA抑制SGC-7901细胞中ATP1B3的表达
（A）在放大100倍的条件下获得SGC-7901细胞明亮荧光的代表性显微照片。感染后48小时，约50%的细胞在荧光显微镜确定的时间点表达FAM。（B）Western Blot检测了SGC-7901细胞和转染siRNA1、siRNA2、siRNA3或si-NC的细胞中ATP1B3蛋白的表达。结果表明，与其他siRNAs相比，ATP1B3-siRNA1是最有效的敲除序列。*与SGC-7901和对照细胞相比，P<0.05。（C）使用siRNA1、siRNA2、siRNA3和si-NC对SGC-7901细胞中ATP1B3 mRNA敲除效率进行qRT-PCR分析。*与对照组相比，P<0.01。三个siRNA片段均显示出良好的ATP1B3 mRNA敲除效率，从平均值来看，siRNA1的干扰效率最高。
图4
图4。敲除ATP1B3导致SGC-7901和MKN-45细胞增殖受到抑制
细胞在96个平板中培养，并通过CCK-8分析。96小时后显示细胞增殖曲线。ATP1B3-siRNA组在450-nm波长处的吸光度值显著低于模拟组和对照组。随着时间的推移，ATP1B3 siRNA细胞的增殖受到更显著的抑制。未感染的模拟对照细胞；对照组，细胞感染si-NC；ATP1B3-siRNA1，感染ATP1B3-siRNA1的细胞；ATP1B3-siRNA3，细胞感染ATP1B3-siRNA3。*与对照组相比，P<0.05。
图5
图5。ATP1B3沉默对胃癌细胞集落形成能力的影响
（A）细胞在6孔板中培养，并通过集落形成分析进行分析。14天后，对细胞进行染色、拍照和计数。SGC-7901和MKN-45细胞形成的集落的代表性图像。（B）与模拟和对照细胞克隆组相比，ATP1B3-siRNA组的克隆大小明显更小，且克隆更分散。（C）SGC-7901和MKN-45细胞集落数的统计分析。数据表示为平均值±SD。这些数据代表了三个独立的实验。*与对照组相比，P<0.05。这些结果表明，ATP1B3敲低抑制了人胃癌细胞的集落形成能力。
图6
图6。流式细胞术检测ATP1B3基因敲除对细胞周期和凋亡的影响
（A）ATP1B3-siRNA转染48小时后，收集四组细胞检测细胞周期分布。结果发现，与SGC-7901和MKN-45细胞的模拟组和对照组相比，ATP1B3-siRNA1和ATP1B3-siRNA3细胞在G2/M期的百分比增加，而G0/G1和S期的细胞百分比减少。数据表示三个独立实验的平均值±SD。*与对照组相比P<0.05，**与对照组相比，P<0.01。因此，ATP1B3的敲除可以阻止胃癌细胞的细胞周期进展。（B）流式细胞术显示，ATP1B3下调诱导胃癌SGC-7901和MKN-45细胞凋亡。与SG-7901和MKN-45细胞的模拟和对照组相比，ATP1B3-siRNA1和ATP1B3-siRNA3组的凋亡细胞数量显著增加。*与对照组相比，P<0.05。
图7
图7。ATP1B3表达下调对胃癌SGC-7901和MKN-45细胞迁移和侵袭性的影响
（A）给出了具有代表性的图像和附带的统计图。ATP1B3-siRNA1和ATP1B3-siRNA3组迁移至下腔的细胞数量明显少于其他组。胃癌细胞ATP1B3下调抑制细胞迁移能力在体外.**与对照组相比，P<0.01。图像是在200倍放大率下获得的。（B）根据Transwell测定，与Mock和对照组相比，ATP1B3-iRNA1和ATP1B3-iRNA3组中SGC-7901和MKN-45细胞的侵袭能力受到抑制。数据显示为平均值±SD。**与对照组相比，P<0.01。图像是在200倍放大率下获得的。
图8
图8。ATP1B3敲低抑制PI3K/AKT信号通路的激活
用Western blot检测ATP1B3表达改变的SGC-7901和MKN-45细胞中PI3K、AKT、p-AKT和Caspase-3蛋白的水平。1为模拟组，2为对照组，3为ATP1B3-siRNA组。Western blotting显示，ATP1B3的敲除导致PI3K和AKT的下调，AKT磷酸化的减弱，以及凋亡相关蛋白Caspase-3的激活。GAPDH被用作内部负荷控制。每个实验重复三次，得到了类似的结果。
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