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.2018年1月2日；475(1):23-44.
doi:10.1042/BCJ20170803。

通过评估人类中性粒细胞中Rab10磷酸化来询问帕金森病LRRK2激酶途径的活性

英凡 1, 安德鲁·J·M·豪登 2, 阿迪尔·萨汉 1, Pawel Lis公司 1, 伊藤根塔 1, 特里娜·马丁内斯 三, 凯瑟琳·布罗克曼 4 5, 托马斯·加斯尔 4 5, 达里奥·阿莱西 6, 埃斯特·桑姆勒 6 7
附属公司

通过评估人类中性粒细胞中Rab10磷酸化来询问帕金森病LRRK2激酶途径的活性

英凡等。 生物化学杂志. .

摘要

有令人信服的证据表明富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）的作用，特别是其激酶功能在帕金森病中的作用。口服生物利用型、脑渗透剂和强效LRRK2激酶抑制剂正处于临床开发的后期阶段。在这里，我们描述了一种通过测量LRRK2-介导的人类外周血中性粒细胞中Rab10磷酸化来量化LRRK2激酶途径活性的简便而稳健的分析。我们使用选择性MJFF-pRab10单克隆抗体识别由LRRK2磷酸化的Rab10-Thr73磷酸化epitope。我们通过研究少数G2019S LRRK2相关和散发性帕金森病患者以及健康对照，强调了在临床环境中使用我们的检测的可行性和实用性。我们认为，外周血中性粒细胞是LRRK2研究的宝贵资源，应考虑将其纳入帕金森氏病的生物蓄积物中，因为它们丰富、同质且表达相对较高的LRRK_2和Rab10。相反，广泛使用的外周血单个核细胞是异质的，只有少数细胞（单核细胞和污染的中性粒细胞）表达LRRK2。虽然我们的LRRK2激酶途径分析可以根据LRRK1激酶活性帮助患者分层，但我们预计在未来的LRRK 2抑制剂试验中，它可能会在药效学和靶向参与研究中发现更大的用途。

关键词：帕金森病；兔10；生物标志物；诊断；富含亮氨酸重复激酶；中性粒细胞。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，与手稿没有任何利益冲突。

数字

图1。
图1.使用immprot数据库中的可用数据，从人体血液中分离的免疫细胞中LRRK2和RAB10蛋白的丰度(网址：http://www.immprot.org)[34].
这项研究使用了通过荧光激活细胞分选从人类血液中分离出来的纯免疫细胞群，并生成了全细胞蛋白质组学数据。使用组蛋白标尺对数据进行分析，以估计每个细胞的蛋白质拷贝数。这些图表显示了一系列外周血免疫细胞（包括T细胞、B细胞、单核细胞、NK细胞、树突状细胞和粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞亚群）中LRRK2和RAB10的每细胞蛋白质拷贝数。
图2。
图2.监测人类中性粒细胞中LRRK2介导的Ser935和Rab10磷酸化。
从12名健康供体中分离出中性粒细胞，并用或不用100 nM MLi-2用于30 最小值(A类)通过流式细胞仪分析评估12名健康志愿者全血中性粒细胞的存活率（DAPI）和纯度（CD66b）。(B类和C类)然后溶解中性粒细胞 µg全细胞提取物，用所示抗体进行定量免疫印迹分析（均为1 μg/ml抗体），并使用Odyssey CLx扫描Western Blot成像系统开发膜。在两个独立的实验中获得了类似的结果。通过分析LRRK2（全长）/GAPDH比率进行免疫印迹定量(Bi公司)，总LRRK2（170 kDa物种）/GAPDH比率(Bii公司)，磷酸盐-Ser935 LRRK2（全长）/总LRRK3（全长）比率(比尔)和磷酸盐-Ser935 LRRK2（170 kDa物种）/总LRRK2（170 kDa物种）比率(Biv公司)，总Rab10/GAPDH比率(Ci公司)，磷酸-Thr73 Rab10/GAPDH比值(Cii公司)和磷酸化-Thr73 Rab10/总Rab10比率(Ciii公司).
图3。
图3：分析对照组和帕金森病患者中性粒细胞中LRRK2-介导的Rab10磷酸化。
从13名健康对照组、7名散发性帕金森病患者和6名杂合子G2019S LRRK2突变患者中分离出中性粒细胞，其中5名为帕金森病，1名为携带者（供体20，以蓝色突出显示）。细胞经100或不经100处理 nM MLi-2用于30 分钟，然后裂解细胞，10 µg全细胞提取物，用所示抗体进行定量免疫印迹分析（均为1 µg/ml抗体），以及使用Odyssey CLx扫描Western Blot成像系统开发的膜。相同提取物的三个独立免疫印迹实验也获得了类似的结果。
图4。
图4：对照组和帕金森病患者中性粒细胞中LRRK2、LRRK2-Ser935磷酸化和Rab10的定量。
对图3中的免疫印迹进行了全长LRRK2/GAPDH比率的定量(A类), ∼170 LRRK2/GAPDH比值的kDa物种(B类)，磷酸盐-Ser935 LRRK2（全长）/总LRRK3（全长）比率(C类)和总Rab10/GAPDH比率(D类).
图5。
图5：对照组和帕金森病患者中性粒细胞中LRRK2-介导的Rab10磷酸化定量。
图3中的免疫印迹定量了磷酸-Thr73 Rab10/GAPDH比率(A类)，磷酸-Thr73 Rab10/总Rab10比率(B类)，LRRK2-依赖性磷酸-Thr73 Rab10/GAPDH比值(C类)和LRRK2-依赖性磷酸化-Thr73 Rab10/总Rab10比率(D类). 数据采用Bonferroni多重比较检验进行单因素方差分析。以平均值表示的数据 ± SD*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.005.
图6。
图6中性粒细胞和PBMC中LRRK2介导的Rab10磷酸化的比较。
(A类)中性粒细胞和PBMC均由相同的6名健康捐赠者制备，并接受或不接受100 nM MLi-2用于30 分钟，然后裂解细胞，10 µg全细胞提取物，用所示抗体进行定量免疫印迹分析（均为1 μg/ml抗体），并使用Odyssey CLx扫描Western Blot成像系统开发膜。(B类)免疫印迹定量分析总LRRK2（全长）/GAPDH(Bi公司)，总Rab10/GAPDH比率(Bii公司)，磷酸盐-Ser935 LRRK2（全长）/总LRRK3（全长）(比尔)和总磷酸化-Thr73 Rab10/总Rab10(Biv公司).
图7。
图7中性粒细胞中LRRK2介导的Rab 10磷酸化的剂量-反应曲线和时间过程分析。
(A类)从两名健康供体中分离出中性粒细胞，并用指示浓度的MLi-2或PF-06447475处理30次 分钟，然后裂解细胞，10 µg全细胞提取物，用所示抗体进行定量免疫印迹分析（均为1 μg/ml抗体），并使用Odyssey CLx扫描Western Blot成像系统开发膜。(B类)通过分析磷酸化-Thr73 Rab10/总Rab10比率进行免疫印迹定量(Bi公司)和磷酸盐-Ser935（全长）/总LRRK2（全长）比率(Bii公司). (C类和D类)上述免疫印迹定量，磷酸-Thr73 Rab10/总Rab10比率(迪)和磷酸盐-Ser935（全长）/总LRRK2（全长）比率(Dii公司)，但中性粒细胞是从两名健康供体中分离出来的，并用浓度为100的MLi-2处理 nM表示指定的时间。在两个独立的实验中也得到了类似的结果。
图8。
图8：评估DIFP对防止中性粒细胞蛋白水解降解的重要性。
(A类)从两名健康献血者中分离出中性粒细胞，并用100 nM MLi-2用于30 在存在或不存在SDS（体积分数为1%）和0.5 mM DIFP，如图所示。全细胞提取物（10 µg）用所示抗体进行定量免疫印迹分析（均为1 μg/ml抗体），并使用Odyssey CLx扫描Western Blot成像系统开发膜。在两个独立的实验中也得到了类似的结果。(B类)如中所示(A类)除了用含有0.5 mM DIFP或提前1周制备并储存在−20或−80°C的相同缓冲液，如图所示。在两个独立的实验中也得到了类似的结果。(C类)如中所示(A类)，除了细胞在0.5 mM（DIFP）或2.5 mM异丙醇PMSF。DIFP的制备温度为0.5 M溶于异丙醇中，并在使用前立即加入裂解缓冲液中。PMSF在0.1时溶解 M加入异丙醇中，并在使用前立即添加到裂解缓冲液中。
图9。
图9在分离到24个的中性粒细胞中检测LRRK2介导的Rab磷酸化 静脉切开后h。
血液取自三名健康献血者，在室温下未经处理。在指定的时间，从血液中分离出中性粒细胞，并在100 30 nM 最小值(A类)然后溶解中性粒细胞 µg全细胞提取物，用所示抗体进行定量免疫印迹分析（均为1 µg/ml抗体），并使用Odyssey CLx扫描蛋白质印迹成像系统开发膜。在两个独立的实验中也得到了类似的结果。(B类)通过分析磷酸化-Thr73 Rab10/总Rab10比率（顶面板）和磷酸化-Ser935（全长）/总LRRK2（全长）比率（底面板）对免疫印迹进行定量。
图10。
图10通过Phos-tag聚丙烯酰胺电泳分析人类中性粒细胞内源性Rab10的磷酸化。
从12名健康献血者中分离出中性粒细胞，并用或不用100 nM MLi-2用于30 分钟，然后裂解细胞，10 微克全细胞提取物进行电泳，其中Phos-tag丙烯酰胺聚合到聚丙烯酰胺凝胶中，以延迟LRRK2-磷酸化Rab10的电泳迁移率。用特异性识别Rab10（1）的抗体对凝胶进行免疫印迹分析 µg/ml抗体），磷酸化和非磷酸化Rab10对应的带分别用开放和填充圆圈标记。显示免疫印迹的低（顶部面板）、中（中间面板）和高暴露（底部面板）。在两个单独的实验中获得了类似的结果。
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