Abrogating Mitochondrial Dynamics in Mouse Hearts Accelerates Mitochondrial Senescence

doi:10.1016/j.cmet.2017.09.023

.2017年12月5日；26（6）：872-883.e5。

doi:10.1016/j.cmet.2017.09.023。 Epub 2017年10月26日。

消减小鼠心脏线粒体动力学加速线粒体衰老

Moshi Song公司¹, 安东尼塔·佛朗哥¹, 朱莉·A·弗莱舍¹, 张丽红¹, 杰拉尔德·多恩第二²

附属公司

¹美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院内科药物基因组学中心。
²美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院内科药物基因组学中心电子地址：gdorn@dom.wustl.edu。

PMID： 29107503
预防性维修识别码：项目经理5718956
内政部： 10.1016/j.cmet.2017.09.023

消减小鼠心脏线粒体动力学加速线粒体衰老

Moshi Song公司等。单元格元. 2017.

.2017年12月5日；26（6）：872-883.e5。

doi:10.1016/j.cmet.2017.09.023。 Epub 2017年10月26日。

作者

Moshi Song公司¹, 安东尼塔·佛朗哥¹, 朱莉·A·弗莱舍¹, 张丽红¹, 杰拉尔德·多恩第二²

附属公司

¹美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院内科药物基因组学中心。
²美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院内科药物基因组学中心电子地址：gdorn@dom.wustl.edu。

PMID： 29107503
预防性维修识别码：项目经理5718956
内政部： 2016年10月10日/星期二2017年9月23日

摘要

线粒体融合和裂变对心脏健康至关重要；基因干扰两者都是致命的。为了了解观察到的心脏表型的基础是融合和裂变的丢失还是融合和裂变之间的不平衡，我们设计了小鼠，其中Mfn介导的融合和Drp1介导的裂变可以同时被废除。与融合缺陷型Mfn1/Mfn2心脏敲除或裂变缺陷型Drp1心脏敲除小鼠相比，Mfn1/1Mfn2/Drp1三重心脏敲除鼠存活时间更长，表现出独特的心肌肥大病理形式。然而，随着时间的推移，分裂和融合的联合废除导致了大量进行性线粒体积累，严重扭曲了心肌细胞的肌群结构。线粒体生物发生与线粒体过剩无关，尽管线粒体蛋白质平衡受损，但有丝分裂仍受到抑制。在老年心脏中也观察到类似但较轻微的缺陷。因此，与分裂和融合之间的动态不平衡有关的心肌病可以通过强迫线粒体失能暂时缓解，但代价是损害线粒体数量控制和加速线粒体衰老。

关键词：心肌病；老鼠；线粒体；线粒体积累；线粒体动力学；线粒体分裂；线粒体融合；线粒体数量控制；线粒体衰老。

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数字

**图1。Drp1诱导的线粒体分裂对小鼠心脏无害**
（A）用于将人类（h）Drp1表达靶向小鼠心肌细胞的双转基因系统的示意图。（B） rTA转基因对照（Ctrl）和25倍过表达转基因（TG）同窝小鼠心脏中Drp1（顶部）和GAPDH（底部）表达的免疫印迹分析。每条车道都是一颗独立的心。奇数车道为男性；连小巷都是女性。右边是其他线粒体动力学蛋白的免疫印迹。Mff是线粒体裂变因子。GAPDH是装载控制。（C）代表性马森氏三色染色法染色50（顶部）和93（底部）周龄小鼠的心脏。比例尺为5 mm。（D）老龄小鼠的体重指数心脏重量（通过t吨-测试）。（E）超声心动图研究。（左）35周龄小鼠的代表性m模式回声。（右）定量分组数据；LV EDD是左心室舒张末期内径。（F）显示Drp1 TG心脏线粒体断裂的典型透射电镜照片（下面板）。定量数据为平均值±SEM。两个白色条都是对照，代表双转基因系统中的每一对转基因。NS无显著性（ANOVA）。（G）谷氨酸/苹果酸刺激的典型心肌线粒体呼吸研究。插图是呼吸控制率的定量组数据（状态3/状态2）（无显著性t吨-测试）。另请参见图S1。

**图2。培养MEF线粒体动力学的消减**
（A）免疫印迹分析显示，在腺芯诱导其各自的floxed基因同时重组后，Mfn1、Mfn2和Drp1缺失。（B） Cre介导的Mfn1/Mfn2/Drp1缺失后4天的活头研究。对照组（Pre）为Mfn1/Mfn2/Drp1三联丝线MEF，无腺芯。表示±SEM，n，单位为bar。（C） Cre介导的Mfn1/Mfn2/Drp1缺失4天后线粒体长径比（长/短轴）和极化状态（TMRE阳性）的共聚焦分析。*是第页<0.05 vs Pre（方差分析）。（D） Cre介导的Mfn1/Mfn2/Drp1缺失后基线和与FCCP解偶联4天后mcParkin的线粒体累积。*是第页与基线预治疗相比<0.05；#与FCCP治疗的Pre（ANOVA）相比，p<0.05。（E） Cre介导的Mfn1/Mfn2/Drp1缺失后4天基线和与FCCP解偶联后的溶酶体-线粒体重叠。*是第页<0.05 vs基线Pre；#与FCCP治疗的Pre（ANOVA）相比，p<0.05。（F）在Cre介导的Drp1单独缺失（开放圆圈；Drp1 floxed）、Mfn1和Mfn2组合缺失（灰色三角形；Mfn1/Mfn2-floxed；或Mfn 1、Mfn 2和Drp1组合缺失（黑色方块；Drp1/MfnCloxed）后，通过腺病毒表达的mito-Keima在增加时间的红移来测量溶酶体吞噬线粒体的速率。另请参见图S2。

**图3。成年小鼠心脏线粒体动力减退**
（A）使用他莫昔芬诱导的心肌细胞定向Cre进行基因重组设计。（B） Cre介导的基因重组后8周龄小鼠心脏Mfn1、Mfn2和Drp1水平的免疫印迹分析是第页<0.05 vs无Cre-Ctrl（方差分析）。（C）心脏Drp1基因敲除（KO）、Mfn1/Mfn2双KO（DKO）的早期致死率因Drp1/Mfn 1/Mfm2三基因消融而延迟。*p<0.05 vs无Cre-Ctrl；#与Mfn1/Mfn2/Drp1 TKO（对数库）相比，p<0.05。（D） Mfn1/Mfn2/Drp1基因联合缺失16周后，代表性Masson三色染色TKO小鼠心脏。基因重组6周后的父系心脏如右图所示。体重秤为5毫米。（E）体重计心脏重量（16周）与体重相关。*是第页<0.05 vs Ctrl(t吨-测试）。（F）心肌肥大基因的RT-qPCR是第页<0.05 vs Ctrl；#与8周TKO相比，p<0.05（方差分析）。

**图4。线粒体动力障碍心脏表型的长期演变**
（A）三苯氧胺诱导基因消融后心脏Drp1/Mfn1/Mfn 2 TKO小鼠的延长生存曲线与无Cre-Ctrl（Log-rank）相比，p<0.05。插入是存活24周的小鼠的代表性心脏；刻度为1 mm。（B）Mfn1/Mfn2/Drp1 TKO心脏超声心动图。左侧是具有代表性的m模式跟踪。计算出的存活小鼠左心室（LV）质量和缩短百分比的组定量数据位于右侧。*与同一时间相比p<0.05(t吨-测试）。（C）心脏和肺重量与胫骨长度相关。*与同一时间相比p<0.05(t吨-测试）。（D）组织学研究。左：小麦胚芽凝集素（WGA，绿色）染色和伊文氏蓝（红色）染色。心肌细胞横截面积（CSA）的中间定量组数据。右侧是坏死Evan’s蓝色染色细胞、凋亡TUNEL阳性细胞和心脏纤维化的分组数据。数据为所示数字的平均值±SEM；*与Ctrl相比p<0.05；#与8周TKO相比，p<0.05（方差分析）。

**图5。无动力心肌细胞线粒体的结构和功能特征**
（A）一个正常Ctrl和两个不同Mfn1/Mfn2/Drp1 TKO小鼠心脏的典型透射电子显微图。注意线粒体大小的异质性和偶尔出现的“幻影”线粒体（白色箭头）。在最低放大倍数的TKO心脏中，明显可见核周线粒体堆积周边移位的肌节。（B）线粒体丰度和形态计量的定量分析。平均值±SEM；*是第页<0.05 vs Ctrl；#是第页<0.05与2周；$是第页<0.05 vs 8周TKO（ANOVA）。（C）分离心肌线粒体的流式细胞术分析。通过前向散射测量左、中、线粒体大小。对，DiOC6测量的线粒体极化定量数据。*是第页<0.05 vs Ctrl(t吨-测试）。（D）谷氨酸/苹果酸刺激线粒体呼吸；代表曲线位于左侧，组数据位于中间。*是第页<0.05 vs Ctrl(t吨-测试）。对，FCCP刺激了最大线粒体耗氧量。另请参见图S3。

**图6。活力丧失后线粒体丰度和蛋白质含量**
（A）线粒体蛋白/心室质量*为第页<0.05 vs Ctrl(t吨-测试）。（B）线粒体DNA/核DNA的qPCR。*是第页<0.05 vs Ctrl（方差分析）。（C）线粒体生物发生因子的RT-qPCR是第页<0.05 vs Ctrl；#与8周TKO相比，p<0.05（方差分析）。（D）线粒体外膜（左）和内膜呼吸复合物（右）蛋白质的定量免疫印迹分析。*是第页<0.05 vs Ctrl（方差分析）。

**图7。Mfn1/Mfn2/Drp1 TKO小鼠心脏蛋白质平衡受损和有丝分裂改变**
（A）线粒体未折叠蛋白反应的诱导。样品为心肌匀浆；GAPDH是加载控制。*是第页与对照组相比<0.05（ANOVA）。（B）心脏线粒体部分的线粒体蛋白。TOM20是加载控制。*是第页<0.05 vs Ctrl；#是第页<0.05 vs Drp1 KO（方差分析）。（C）心肌匀浆中的大自噬蛋白。GAPDH是加载控制。*是第页<0.05 vs Ctrl（方差分析）。底部GAPDH是LC3螺栓的加载控制。另请参见图S4和S5。

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