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.2017年11月1日；58(6):816-826.
doi:10.1093/jrr/rrx033。

CD44标准亚型与胰腺癌细胞的放射抗性有关

肯托·通布奇 1, Kazumasa南美 1, Naoki Hayashi先生 1, Yuki Yokoyama（横山由纪夫） 2, 森喜朗（Seiji Mori） 三, 山本博文 2, 小泉正彦 1
附属公司

CD44标准亚型与胰腺癌细胞的放射抗性有关

肯托·通布奇等。 J辐射研究. .

摘要

对放化疗的抵抗是这些治疗后胰腺癌复发率增加的原因之一。这些细胞在获得化学或放射抗性的同时，改变了几种蛋白质的表达水平，如上皮-间充质转化（EMT）。在这项研究中，我们重点关注CD44，一种胰腺癌干细胞标记物。CD44具有不同功能的亚型：标准亚型（CD44s）和几种不同亚型（CD44v）。然而，人们对电离辐射后这些亚型的作用知之甚少。本研究旨在探讨CD44亚型在胰腺癌细胞放射抗性中的作用。用4 MV X射线照射人胰腺癌细胞株AsPC-1。与照射后的CD44v相比，CD44s的mRNA和蛋白水平显著上调，且呈剂量依赖性。因此，我们在细胞增殖点进一步研究了CD44。我们使用CD44s敲除细胞评估细胞增殖和存活。CD44s敲除在照射后72小时内没有改变增殖率，但在集落形成试验中降低了细胞活力。作为这些影响的原因之一，我们发现磷酸化细胞外信号调节激酶（Erk；与细胞增殖有关）通过CD44s敲除而下调，且具有时间依赖性。此外，辐射诱导的EMT样表达变化被检测到，并被CD44s敲除所抑制。总之，我们的工作表明，在高剂量X射线照射后，CD44标准亚型在CD44的几个亚型中特别上调，并通过维持Erk磷酸化和辐射诱导的EMT促进照射后的长期细胞存活。

关键词：CD44；EMT；X射线；肿瘤干细胞；上皮-间充质转化；抗辐射性。

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数字

图1。
图1。
X射线照射24小时后CD44流式细胞术分析结果。（A） 每行代表同型对照（紫色）和CD44在0 Gy（黑色）、0.5 Gy（橙色）、2 Gy（红色）和8 Gy（粉红色）照射后的荧光。纵轴显示细胞计数，横轴显示CD44-FITC的对数荧光。带有M3的横条表示CD44阳性细胞的阈值。（B） 该图显示了CD44阳性（CD44+)单元格。每个条形代表平均±标准偏差。(*P（P）<0.05 vs 0 Gy）。
图2。
图2。
定量RT-PCR结果。每个图显示X射线照射后24小时、48小时和72小时的表达式（A）、（B）和（C）。CD44和CD44标准亚型的所有亚型（CD44total）、外显子11（CD44v6）、外外显子14（CD44v9）、外显子15（CD44v10）的mRNA表达通过未照射细胞（0 Gy）的表达进行标准化。根据GAPDH的表达式，采用ΔΔCt法计算这些值。每个条形代表平均±标准偏差。(*P（P） < 0.05, **P（P）<0.01 vs 0 Gy）。
图3。
图3。
CD44的Western blotting结果。显示X射线照射后24 h和48 h CD44蛋白（A）的表达。β-肌动蛋白作为对照。每个图显示了X射线照射后24小时和48小时由β-肌动蛋白（B）和（D）归一化的每条带的密度。这些值通过未辐照细胞的密度（0 Gy）进行归一化。每个条形代表平均±标准偏差。(*P（P） < 0.05, **P（P）<0.01 vs 0 Gy）。
图4。
图4。
CD44s敲除的确认。（A） 确认时间表。（B） siRNA敲除后的定量RT-PCR结果。mRNA表达通过对照细胞的表达进行标准化。根据GAPDH的表达式，采用ΔΔCt法计算值。每个条形表示平均±标准偏差。（C，D）siRNA敲除后的蛋白质印迹结果。用β-肌动蛋白（β-actin）作为对照。该图显示了由β-肌动蛋白密度归一化的每条带的密度。这些值由对照细胞的值进行标准化。每个条形表示平均±标准偏差。(*P（P） < 0.05, **P（P）<0.01与对照†P（P） < 0.05, ††P（P）<0.01 vs siNC，n.s.=不显著）。
图5。
图5。
X射线照射后CD44s敲除对细胞增殖和存活的影响评估。（A） WST-1试验和菌落形成试验的时间表。WST-1分析结果。每一条代表平均值±标准偏差。（B） 对照细胞的相对生长长达72小时。这些值由未辐照细胞进行标准化。（0戈瑞）(*P（P） < 0.05, **P（P）<0.01 vs 0 Gy）。（C） 未辐照细胞和8Gy辐照细胞的相对生长。通过对照细胞的未照射细胞（0Gy，对照）对这些值进行归一化。（D） 相对生长长达72小时。各条件下的未辐照细胞对数值进行了标准化。（0戈瑞）(*P（P） < 0.05, **P（P）每种情况下<0.01 vs 0 Gy，n.s.=无显著差异）。（E） 基于克隆形成分析的每种条件的存活曲线。对于每组条件，通过（照射细胞的菌落数）/（未照射细胞）计算存活率（纵轴），并以对数标度进行描述。每个图表示平均±标准偏差。(**P（P）<0.01 siCD44s与对照组，†P（P）<0.05 siCD44s与siNC）
图6。
图6。
CD44s敲除对与细胞增殖和存活相关的几种蛋白质的影响评估。（A） 收集蛋白裂解物的时间表。X射线照射后24 h和72 h Erk（B）和（C）蛋白印迹结果。β-actin作为对照。（D） X射线照射72小时后上皮-间充质转化（EMT）相关蛋白的Western blotting结果。β-actin作为对照。E-cadherin作为上皮标记物，vimentin作为间充质标记物，Slug和Zeb1作为EMT标记物。
图7。
图7。
X射线照射后24 h、48 h和72 h或siCD44s转染后24 h CD44s mRNA与CD44v6mRNA的比值。根据定量RT-PCR结果计算数值（图2和图4）。每个条形代表平均±标准偏差。[（A–C）*P（P） < 0.05, **P（P）<0.01 vs 0 Gy，†P（P）<0.05 2 Gy vs 8 Gy，（D）**P（P）与对照组相比<0.01††P（P）<0.01 vs siNC。]
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