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.2017年11月;14(5):4181-4193.
doi:10.3892/etm.2017.5098。 Epub 2017年9月1日。

内源性Nampt上调通过NF-κB p65和Sirt1通路与糖尿病肾病炎性纤维化相关;NMN通过抑制内源性Nampt减轻糖尿病肾病炎性纤维化

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内源性Nampt上调通过NF-κB p65和Sirt1通路与糖尿病肾病炎性纤维化相关;NMN通过抑制内源性Nampt减轻糖尿病肾病炎性纤维化

叶晨等。 实验治疗学. 2017年11月.

摘要

烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的关键酶+)生物合成途径。据报道,外源性胞外Nampt可增加各种类型肾细胞中原纤分子的合成。然而,内源性Namptenzymatic活性在糖尿病肾细胞中的作用,尤其是通过核因子(NF)-κB p65和sirtuin 1(Sirt1)途径与炎症和纤维化相关的细胞,尚不清楚。在本研究中,内源性Nampt上调影响促炎和促纤维化细胞因子表达的可能机制体内体外,已报告。目前的结果表明,波形蛋白和纤维连接蛋白的表达与内源性Nampt上调直接相关。与对照组相比,在96 h时,与内源性Nampt上调反应相比,Poly(ADP-核糖)聚合酶-1、NF-κB p65、叉头盒蛋白O1和B细胞淋巴瘤2样蛋白4的表达水平也分别显著增加(P<0.01)。此外,在STZ诱导的糖尿病大鼠中,Sirt1的表达水平显著降低(P<0.05),NAD和NADH水平以及NAD/NADH比值显著改变(P<0.01)。FK866和烟酰胺单核苷酸(NMN)治疗分别导致波形蛋白和纤维连接蛋白的下调。这些结果表明,Nampt作为系膜纤维化信号的促炎细胞因子具有新的作用。Nampt-NF-κB p65和Sirt1信号通路在影响糖尿病肾病(DN)肾小球纤维化过程中纤维化因子的表达中起着关键作用。还表明,预防内源性Nampt上调可能对治疗DN促炎性纤维化至关重要,NMN可能是治疗难治性DN肾病纤维化的潜在药物。

关键词:Nampt;糖尿病肾病;纤维化;核因子-κB p65;氧化应激;西尔图因1。

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数字

图1。
图1。
链脲佐菌素诱导的糖尿病Sprague-Dawley大鼠内源性Nampt上调。使用免疫组织化学评估正常和糖尿病大鼠组织的(A)肝脏、(B)胰岛、(C)肌肉和(D)肾组织中内源性Nampt的表达和定位。棕榈红表示细胞中的Nampt表达水平。Nampt,烟酰胺磷酸核糖转移酶。放大倍数,×40,比例尺=100µm。
图2。
图2。
链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠和正常大鼠组织中的Nampt和PARP-1表达水平。用Nampt、PARP-1和β-actin抗体(对照)对大鼠组织裂解物进行western blot分析;实验至少进行了两次。显示了带的代表性图像。数据以每组3只大鼠的3个胰腺切片的平均值±标准偏差表示。(A-D)与正常大鼠相比,糖尿病大鼠肝、胰腺、肌肉和肾脏组织中Nampt和PARP-1的表达水平明显增加,##与对照组相比,P<0.01。烟酰胺磷酸核糖转移酶;PARP-1,聚(ADP-核糖)聚合酶-1;带1,肝脏;带2,胰腺;带3,肌肉;带4,肾。
图3。
图3。
糖尿病大鼠组织中NAD和NADH水平的变化。在(A)红细胞、(B)肌肉、(C)胰腺、(D)肝和(E)肾组织中测量NAD/NADH比值。在相同的总蛋白浓度下对总共4个组织样本进行评估。数据以每组3只大鼠的平均值±标准偏差表示。##与正常大鼠组织相比,P<0.01。NAD,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
图4。
图4。
氧化应激影响的HBZY-1细胞中内源性Nampt和NF-κB p65表达增加,Sirt1表达降低。(A) HBZY-1细胞在高糖培养基(200 mmol/l作为氧化应激环境)中培养24、48、72、96、120或144小时,然后通过western blot分析测定内源性Nampt、NF-κB p65、Sirt1和β-actin蛋白的表达水平。给出了(B)Nampt、(C)NF-κB p65和(D)Sirt1水平的定量。每组重复三次独立实验。数据表示为三个实验的平均值±标准偏差。#P<0.05,##与24小时治疗组相比,P<0.01。烟酰胺磷酸核糖转移酶;Sirt1,sirtuin 1;NF,核因子。
图5。
图5。
(A-D)为了使用荧光显微镜评估细胞形态,将HBZY-1细胞暴露于高糖下120 h,然后固定并用Alexa Fluor 488-和Alexa Fluor 594-结合的兔抗Nampt、NF-κB p65和Sirt1抗体和DAPI(蓝色)染色,以进行核可视化。在3个独立的实验中也得到了类似的结果。(A和C)在图像中,Nampt染色显示为绿色,NF-κB p65或Sirt1染色显示为红色。合并图像显示,大多数Nampt着色与NF-κ)B p65和Sirt1共存。(B和D)阳性信号归一化为细胞面积(积分密度/mm2)并使用Image J软件进行定量分析。在每个肾脏切片中,分析包含~100个细胞的≥10个区域。数据表示为四个独立实验的平均值±标准偏差(每个实验约50个细胞)。放大倍数,×40,比例尺=25µm。##与对照组相比,P<0.01。烟酰胺磷酸核糖转移酶;NF,核因子;Sirt1,sirtuin 1。
图6。
图6。
(A) 暴露于高糖环境中24、48、72或96 h的HBZY-1细胞内源性Nampt、NF-κB p65、Sirt1、FoxO1和Bax蛋白表达的时间进程。western blot分析的定量显示了(B)Nampt,(C)NF-κ子B p65,(D)Sirt1,(E)FoxOl和(F)Bax以及β-actin的蛋白表达水平。数据表示为三个实验的平均值±标准偏差。#P<0.05,##与24小时相比,P<0.01(对照组)。烟酰胺磷酸核糖转移酶;NF,核因子;Sirt1,sirtuin 1;FoxO1,叉头盒蛋白O1;Bax,B细胞淋巴瘤2样蛋白4。
图7。
图7。
糖尿病小鼠肾脏组织中内源性Nampt、波形蛋白和纤维连接蛋白的表达。虚线的内圈表示肾小球细胞,肾小球细胞被肾小管细胞包围。(A-D)Nampt(绿色)和纤维连接蛋白或波形蛋白(红色)双重免疫染色的代表性图像。细胞核用DAPI(蓝色)染色。放大倍数,×64,比例尺=100µm。(E) 糖尿病小鼠肾脏组织细胞中内源性Nampt和vimentin的表达水平显著高于对照小鼠的细胞。(F) 同样,糖尿病小鼠组织中的纤维连接蛋白水平显著高于对照小鼠。使用Image J软件分析图像。数据表示为每组3只小鼠的平均值±标准偏差和每只小鼠的3个肾脏切片。在每个肾脏切片中,分析包含~100个细胞的≥10个区域。##与对照组相比,P<0.01。放大倍数,×64,比例尺=100µm。Nampt,烟酰胺磷酸核糖转移酶。
图8。
图8。
(A-D)在暴露于高糖的细胞中内源性Nampt上调后,波形蛋白和纤维连接蛋白过度表达。在高血糖条件下暴露72小时后,通过免疫荧光染色评估内源性Nampt、vimentin和纤维连接蛋白的表达水平。(A和C)显示了Nampt(绿色)和波形蛋白或纤连蛋白(红色)的双重免疫染色的代表性图像。细胞核用DAPI(蓝色)染色。放大倍数,×40,比例尺=25µm。(B和D)使用Image J软件分析所有图像。数据表示为三个实验的平均值±标准偏差。##与对照组相比,P<0.01。Nampt,烟酰胺磷酸核糖转移酶。
图9。
图9。
NMN对糖尿病肾组织Nampt、NF-κB p65和波形蛋白RNA表达的影响。NMN调节Nampt-NF-κB p65和Sirt1信号通路,参与波形蛋白的干预表达体内糖尿病大鼠接受NMN治疗20天。对糖尿病大鼠Nampt、NF-κB、Sirt1和波形蛋白的mRNA表达进行了分析。β-actin作为负荷对照。PCR产物的相对密度值=目标基因灰度值/β-肌动蛋白灰度值。实验一式三份,给出了三个实验的平均值±标准偏差。##与DN相比,P<0.01。车道1,DN rat;车道2,DN rat+NMN。烟酰胺单核苷酸;烟酰胺磷酸核糖转移酶;NF,核因子;Sirt1,sirtuin 1;DN,糖尿病肾病。
图10。
图10。
时间和剂量过程对HG培养的HBZY-1细胞表达Sirt1的影响。(A) 将HG培养基中的细胞加入或不加入1mmol/l NMN处理0、24、48或72h,并通过western blot分析Sirt1蛋白的表达。β-actin作为负荷对照。#P<0.05,##与无NMN相比,P<0.01。(B) 用0、0.5、1或2mmol/l NMN处理HG培养基中的细胞24 h,并用western blotting分析Sirt1蛋白的表达。β-actin作为负荷对照。##P<0.01 vs.0 mmol/l。实验进行了三次,给出了三次实验的平均值±标准偏差。Sirt1,sirtuin 1;高血糖;NMN,烟酰胺单核苷酸。
图11。
图11。
波形蛋白和纤维连接蛋白的表达水平由内源性Nampt调节。(A-D)在HG培养基中培养5天后,用10µmol/l FK866或1 mmol/l NMN再处理HBZY-1细胞24小时。随后,通过western blot分析测量内源性Nampt、vimentin、fibronectin和β-actin蛋白表达水平。(A-D):1、低血糖对照组;2、低血糖+FK866;3、低血糖+NMN;4,汞;5、HG+FK866;6、HG+NMN;7、HG+FK866+NMN。#P<0.05和##如图所示,P<0.01。(E-H)在HG环境中孵育4天后,分别用10µmol/l FK866和1 mmo/l NMN处理HBZY-1细胞24 H,其中内源性Nampt、NF-κB p65、Sirt1和β-actin蛋白表达水平通过western blot分析测量。(E-H):1、NG对照组;2、HG;3、HG+FK866;4、HG+NMN;5、HG+FK866+NMN。#P<0.05和##P<0.01对2。数据表示为三个实验的平均值±标准偏差。每个western blot实验均进行三次。NS,不显著;烟酰胺磷酸核糖转移酶;烟酰胺单核苷酸;高血糖;NF,核因子;Sirt1,sirtuin 1。

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