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.2017年11月3日；7(1):14488.
doi:10.1038/s41598-017-14795-x。

亲环素D调节线粒体ATP合酶向合酶体的动态组装

吉塞拉·贝特纳 1, Ryan E Alanzalon公司 1, 小乔治·A·波特 2 三 4
附属公司

亲环素D调节线粒体ATP合成酶合成合成酶的动态组装

吉塞拉·贝特纳等。 科学代表. .

摘要

线粒体电子传递对氧化磷酸化（OXPHOS）至关重要。电子传递链（ETC）活性产生一个电化学梯度，ATP合成酶利用该梯度生成ATP。ATP合成酶被组织成超分子单位，称为合成酶体，可提高ATP生成效率，而ATP合成素内是亲环素D（CypD）调节的线粒体通透性转换孔（PTP）。我们研究了合成酶体是否是响应代谢需求的动态结构，以及CypD是否调节这种动态。从野生型（WT）和CypD基因敲除（KO）小鼠分离的心脏线粒体进行处理，以刺激OXPHOS或打开PTP。通过自然电泳、免疫沉淀和蔗糖密度离心法研究线粒体合胞体的存在和动力学。我们发现，刺激OXPHOS、抑制PTP或删除CypD都会增加高阶合成酶组装。相反，OXPHOS抑制或PTP开放增加了WT中合成酶的分解，但CypD-KO心脏线粒体中没有。CypD活性也与其他组织中的合成酶组装相关，如肝脏和大脑。我们得出结论，CypD不仅调节PTP，而且还根据线粒体的生物能量状态调节合成酶组装的动力学。

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作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
小鼠心脏线粒体中的合胞体。(A类)CN-PAGE转移到硝化纤维素膜上后的Ponceau S染色显示出单体ETC复合物（Cx）I、V和III以及超复合物（SC）的独特模式。(B类)代表性凝胶内分析（IGA；n = 8） 显示了多条带中的ATP水解活性。(C类)ATP5A（n）的免疫印迹（IB） ≥ 10） 和ATP5G（n = 2） 展示CN凝胶中的单体（M）、二聚体（D）、四聚体（T）和合成酶体（Syn）。平行标记中，CypD（n = 5） 和mtCK（n = 5） 仅存在于高分子量蛋白质复合物中。(D类)结合体与ATP合成酶抗体（Cx-V，n）的免疫沉淀（IP） ≥ 5） ，ANT（n = 3） 和CypD（n = 2） 然后是IB对ATP5A（n = 5） ，mtCK（n = 3） ，OSCP（n = 2） ，CypD（n = 3） 和ATP5G（n = 1). (E类)用抗ATP合成酶（Cx-V）、OSCP和CypD抗体获得的沉淀不包含Cx-I的亚单位NDUFAB1，而Cx-I和Cx-III的IP包含（n = 3). 分子量（MW）标记的位置（以kDa为单位）由箭头指示(A类——C类).
图2
图2
呼吸刺激合成体的形成。(A类)血氧记录；黑色箭头表示添加底物或药物（MG:（3 mM苹果酸/5 mM谷氨酸）、1 mM ADP、0.1 mM白术苷（ATR）或2µg/ml寡霉素（当在V最大值或Oligo2当以V添加时最大值)通常每2分钟一次。红色箭头表示采集样本进行CN电泳的时间。(B类)V期合成酶水平最高最大值（设置为100%）与V相比0和ATR（n = 6） ，而寡霉素（Oligo2)无显著影响（n = 3). (C类)V添加寡霉素最大值（寡核苷酸2)不影响合成酶组装，但在OXPHOS刺激前添加寡霉素（Oligo1)阻止了合成酶体的组装。对于B、C：顶部面板显示密度定量（*p≤与V相比0.05最大值ANOVA），中间面板表示原生IB，其中扫描Syn（synthasome）指示的区域进行密度分析。底部面板显示VDAC的变性免疫印迹，以证明样品的装载量相等。M、 D和T是指ATP合成酶的单体、二聚体和四聚体。(D类)V处线粒体最大值（顶部面板）和V抑制后最大值使用0.1 mM ATR（下面板），用2µg月桂基麦芽糖苷/µg蛋白质和合成酶溶解，并通过蔗糖颗粒离心分离。CN-IB检测每个组分的ATP5A并测量ATP合成酶活性（n = 2，斑点上的黑线）。从左到右（箭头方向）梯度增加的分子量以及组分9和13的分子量标记蛋白甲状腺球蛋白（669 kD）和蓝色右旋糖酐2000（2000 kD）的吸光度读数最高。CN IB的MW标记位置（单位：kDa）显示在IB的左侧。
图3
图3
通透性转变导致合成酶体的分解。A： 60µM游离钙诱导线粒体PT2+（箭头），并被0.5 mM ADP或200 nM CsA抑制（上图），或在添加250µM EGTA后逆转（箭头；下图）。PT的发生以吸光度表示(A类)Ca时吸光度过高2+加法（A0). (B类)密度分析显示Ca2+-诱导的PT降低了合成酶水平，而0.5 mM ADP和200 nM CsA（n = 7); 计算ADP（*p）存在时相对于信号的变化≤0.05，**p≤方差分析0.03）。中间面板显示典型的CN印迹。(C类)0.5 mM ADP、10µM bongkrekic acid（BKA）和200 nM CsA抑制PT并保存合成酶，而ATR介导PT并降低合成酶水平（n = 4). 在无底物或钙的等张无EGTA甘露醇-蔗糖缓冲液中，将PT抑制剂或诱导剂直接添加到线粒体中2+在B和C的中间面板中，使用抗ATP5A标记ATP合成酶的单体（M）、二聚体（D）、四聚体（T）和合成酶（Syn）。MW标记的位置显示在左侧。VDAC的变性免疫印迹显示每个印迹下的样品负载相等。
图4
图4
CypD KO小鼠心脏中的合胞体水平较高，但动态性较差。(A类)CN-PAGE后的ATP合成酶凝胶内分析（IGA）和免疫印迹（IB，用于ATP5A）显示CypD KO心脏中的合成酶（Syn）比WT心脏（上面板）中的更多，并通过密度定量（下面板，任意单位（au））（n = 4，*p≤0.05，**p≤0.001（通过T检验）。请注意，ATP合成酶IGA产生白色反应产物，因此阴影是正确的。(B类)和(C类)在OXPHOS（B，n = 3） 和钙2+-感应PT（C，n = 4). 指出了实验条件。（缩写和浓度：V0：3 mM苹果酸/5 mM谷氨酸，V最大值：1 mM ADP，ATR:0.1 mM白术苷，寡糖：2µg/ml寡霉素（在V最大值)，CsA:200 nM环孢菌素A，Ca2+（低）：60µM，钙2+（高）：1 mM）。方差分析显示，各组间无显著差异。B中IB中的虚线垂直线表示从同一IB移动ATR通道以进行演示。(D类)WT和CypD KO线粒体在B（OXPHOS； + 镁2+)和C（PT；无镁2+)并且分别示出了类似于B和C的图案。扫描每条车道中含有合成体的区域（Syn）进行分析。M、 D和T分别指ATP合成酶的单体、二聚体和四聚体。CN IBs的MW标记的位置（以kDa为单位）显示在IBs的左侧。在VDAC的B-D变性免疫印迹中，每个印迹显示样品的负载相等。
图5
图5
V期合成体的形成最大值不是由于线粒体基质渗透压的改变。(A类)将来自WT和CypD KO心脏（250µg）的分离线粒体暴露在缓冲液（0.5 ml）中15分钟，在缓冲液中调节甘露醇和蔗糖的浓度，以使最终渗透压正常（300 mOsm）、低（200 mOmm）和高（400 mOsms）或在无EGTA甘露醇/蔗糖缓冲液（Ctr）中。M、 D、T和Syn分别指ATP合成酶的单体、二聚体、四聚体和合成酶体。CN IB的MW标记位置（单位：kDa）显示在IB的左侧。VDAC的变性免疫印迹显示每个印迹下的样品负载相等。(B类)量化显示渗透条件对WT中合成酶体的流行率没有影响(□, n个 = 4） 和CypD KO(■, n个 = 3） 通过方差分析评估线粒体。
图6
图6
CypD活性与心脏、肝脏和大脑线粒体中的合成酶水平相关(A类)心脏（H）、肝脏（L）和大脑（B）线粒体的CN PAGE显示出不同的ATP合成酶组装模式（左、M、D、T和Syn分别指单体、二聚体、四聚体和合成酶体）。定量显示组织间合成酶水平的差异（右，n = 7，页≤0.01）。(B类)与心脏和肝脏线粒体相比，大脑合成体中发现的CypD更少（n = 5; 第页≤0.03). (C类)与变性IBs的肝脏和心脏相比，CypD在大脑中的总表达较低（n = 7，页≤0.01）。(D类)环孢菌素A敏感肽基丙基顺式/反式与心脏和肝脏线粒体（n）相比，大脑中的异构酶活性较低 = 4，第页≤0.005). (E类)当归一化为ATP5A的总表达时，肝脏中PPIase的比活性高于心脏和大脑线粒体（n = 5; 第页≤0.02). 所有通过方差分析进行的比较。
图7
图7
CypD调节合成酶组装和PTP形成的模型。ATP合成酶（蓝色复合物）的单体组装成二聚体和四聚体，然后根据心肌细胞的生物能量需要，与ANT、PiC和mtCK组装成高阶低聚物（合成酶）。CypD，可能被乙酰化激活，抑制合酶体组装并增加单体的数量，单体可以分解以暴露c亚单位环（PTP型号#1）和二聚体（PTP型号#2）（更多细节请参见讨论）。
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