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.2017年8月7日；8(44):76770-76782.
doi:10.18632/onctarget.20010年。 电子采集2017年9月29日。

三叶因子3通过调节HIF-1α参与胶质瘤的恶性化

朔刁 1, 郑向前 2, Jian Gao公司 三, 姚一群 1, 任思阳 1, 刘永健 4, 徐英辉 1
附属机构

三叶因子3通过调节HIF-1α参与胶质瘤的恶性化

朔刁等。 Oncotarget公司. .

摘要

三叶因子3（TFF3）在几种实体瘤中起重要作用。然而，TFF3在胶质母细胞瘤（GBM）中的表达模式和功能尚未见报道。在此，我们报告了TFF3在胶质瘤中的表达水平显著升高，并与胶质瘤患者的预后相关。然后我们发现TFF3促进胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，并抑制胶质瘤细胞凋亡在体外延迟皮下异种裸鼠的肿瘤进展，延长原位异种小鼠的中位生存时间。此外，TFF3的敲除通过低氧依赖性方式降低HIF-1α的表达。这些发现表明靶向TFF3可能为恶性胶质瘤的治疗干预提供一种新的策略。

关键词：HIF-1α；TFF3；细胞凋亡；胶质母细胞瘤；增殖。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突作者没有潜在的利益冲突需要披露。

数字

图1
图1。TFF3在胶质瘤中过度表达，可作为不良临床结局的指标
（A）用抗TFF3抗体对人脑胶质瘤组织样本进行免疫组化，显示细胞核和细胞质均呈阳性，每个等级各显示一个代表性。正常脑组织样本呈阴性染色（B）TFF3的表达，以WHO I-II级到IV级的染色强度表示，显示IV级和I-II级、III级之间的统计显著差异(P（P）<0.001，n=92，I-II=23，III=31，IV=38）。（C）Western blotting分析显示，TFF3的总体表达倾向于从正常脑（NB）到低度胶质瘤（WHOⅠ-Ⅱ级），然后到高级胶质瘤（世卫组织Ⅲ级和Ⅳ级）的顺序增加。用NB对两个印迹的结果进行归一化。（D）qRT-PCR显示高级别胶质瘤组织中TFF3 mRNA的表达水平显著高于低级别胶质瘤(P（P）<0.01，n=40）。（E）qRT-PCR检测五种胶质瘤细胞系和五种正常脑组织中TFF3 mRNA的相对表达。数据显示为平均值+SD（n=3）。（F）74例胶质瘤患者TFF3表达与生存相关性的Kaplan-Meier分析。
图2
图2。TFF3促进U87和U251的增殖、迁移、侵袭并抑制凋亡
（A）慢病毒稳定敲低后U87和U251细胞系中TFF3蛋白的蛋白质印迹分析。（B）通过6小时和12小时BrdU脉冲试验测定U87和U251细胞增殖（平均值+SD，每组3个生物独立样本，显示一个代表性实验，实验重复3次*P（P）<0.05, **P（P）<0.01）。（C，D）人脑胶质瘤细胞系U87和U251的跨阱迁移和侵袭实验。显示了具有代表性的图像。对五个随机视野中的细胞进行计数，并表示为每个视野中的平均细胞数(*P（P）<0.05, **P（P）<0.01）。（E）蛋白质印迹分析以确定U87和U251细胞中TFF3对侵袭相关蛋白MMP2的调节。数据显示为平均值+SD（n=3）***P（P）<0.001.（F）Western blot分析表明，TFF3敲除增加裂解的caspase3和caspase9，并降低p-AKT（S473）。数据显示为平均值+SD（n=3）*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001.（G）流式细胞术分析显示，U87和U251在TFF3敲除后增加了细胞凋亡率，第一象限表明细胞凋亡早期。
图3
图3。HIF-1α在胶质瘤中的表达及其与TFF3的关系
（A）Western blotting分析显示，HIF-1α的总体表达倾向于从NC（正常脑）到低度胶质瘤（WHO分级I-II），再到高度胶质瘤（卫生组织分级III和IV）的顺序增加。（B）用抗HIF-1α抗体对人脑胶质瘤组织样本进行免疫组化，显示细胞核阳性，每个等级显示一张代表性图片。（C）HIF-1α的表达，以WHO I-II级到IV级的染色强度表示，显示IV级和I-II级、III级之间的统计显著差异(P（P）<0.001，n=92）。（D）92例人脑胶质瘤切片中TFF3和HIF-1α的相关性（Spearman相关系数=0.312，P（P）<0.01）。（E、F）用抗TFF3和抗HIF-1α抗体对人肿瘤切片、U87和U251细胞进行染色。
图4
图4。HIF-1α促进U87和U251的增殖、迁移和侵袭
（A）慢病毒稳定击倒U87和U251细胞株后HIF-1α蛋白的Western blotting分析*P（P）<0.05.（B）通过6小时和12小时BrdU脉冲试验测定U87和U251增殖（平均值+SD，每组3个生物独立样本，显示一个代表性实验，实验重复3次*P（P）<0.05, **P（P）<0.01）。（C，D）人脑胶质瘤细胞系U87和U251的跨阱迁移和侵袭实验。显示了具有代表性的图像。对五个随机视野中的细胞进行计数，并表示为每个视野中的平均细胞数(*P（P）<0.05, **P（P）<0.01）。（E、F）Western blot分析检测HIF-1α对U87和U251细胞侵袭相关蛋白MMP2的调节。数据显示为平均值+SD（n=3）*P（P）<0.05, **P（P）<0.01.
图5
图5。HIF-1α对TFF3介导的胶质瘤细胞功能至关重要
（A）Western blotting显示在TFF3敲除的细胞系中HIF-1α蛋白表达水平显著降低(**P（P）<0.01）。（B）用抗TFF3或抗HIF-1α抗体免疫沉淀TFF3稳定过度表达的U87细胞裂解物，并进行免疫印迹分析。（C）裸鼠肿瘤标本抗HIF-1α抗体免疫组化。（D）用HRE荧光素酶载体转染稳定的TFF3敲低U87和U251细胞，并检测HRE转录活性(*P（P）<0.05).（E、F）qRT-PCR检测VEGF、CA9和MMP2 mRNA(*P（P）<0.05, **P（P）<0.01）。
图6
图6。沉默TFF3可延缓肿瘤进展并延长颅内异种移植小鼠的生存期
（A）用siTFF3、siHIF-1α和NC慢病毒转染U87细胞，并在4-6周龄BALB/c nu/nu小鼠的前肢尾侧皮下注射。（B）皮下肿瘤被切除，肿瘤体积有显著差异(*P（P）<0.05).（C）上述四种稳定转染U87细胞系颅内异种移植小鼠的Kaplan-Meier生存曲线(P（P）<0.01）。（D）颅内异种移植小鼠中所有GFP阳性细胞中磷酸化H istone H3阳性细胞的百分比（n=20，每组5只小鼠，*P<0.05，**P<0.01）。（E）显示了具有代表性的图片。绿色为GFP染色，红色为pH3染色。
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