NLRP11干扰MAVS信号体抑制I型干扰素信号和病毒诱导的凋亡
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PMID： 29097393 -
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NLRP11干扰MAVS信号体抑制I型干扰素信号和病毒诱导的凋亡
摘要
数字
A–C 用ISRE或IFN‐β启动子报告质粒和pRL‐TK质粒以及空载体（EV）或NLRP11构建物转染293T细胞24小时，然后用poly（I:C）（5μg/ml）（A）、poly（dA:dT）（5微克/毫升）（B）转染，或感染仙台病毒（SeV）（MOI=0.1）20小时（C）， 然后进行ISRE‐或IFN‐β依赖荧光素酶活性（折叠诱导）分析。 用ISRE‐luc或IFN‐β-luc的值除以TK‐lux的值对数据进行归一化，然后分析各组的结果以与对照组进行比较。 D类 用IFN‐β启动子报告质粒和pRL‐TK质粒转染293T细胞，连同空载体或cGAS和STING质粒以及增加的NLRP11，转染24h，并分析IFN∙β依赖性荧光素酶活性（折叠诱导）。 E类 对用表达空载体或shNLRP11‐#1的重组慢病毒稳定转导的THP‐1细胞中的总IRF3和磷酸化IRF3进行免疫印迹分析，这些细胞未经治疗或感染SeV（MOI=1）达指定时间点。 两个印迹之间的数字分别表示磷酸化蛋白质相对于总蛋白质的密度测定。 F、 G公司 的表达式 IFNB1公司 , ISG54， 和 ISG56标准 mRNA输入 NLRP11型 过表达THP‐1细胞（F）或 NLRP11型 在指定的时间点击倒感染SeV（MOI=1）的THP‐1细胞（G）。
A、 B类 基于慢病毒 NLRP11型 （A） 或 NLRP11型 特异性shRNAs（GIPZ shRNAset）（B）（嘌呤霉素耐药性）感染THP‐1细胞。 接下来，使用嘌呤霉素选择这些细胞至少2周。 免疫印迹分析 NLRP11型 具有抗NLRP11抗体的THP‐1细胞中过度表达（A）或敲除（B）。 C类 对用表达空载体或shNLRP11‐#1的重组慢病毒稳定转导的THP‐1细胞中的总IRF3和磷酸化IRF3进行免疫印迹分析，这些细胞未经治疗或感染HSV‐1（MOI=1）12 h。 D类 的表达式 IFNB1公司 , ISG54， 和 ISG56标准 mRNA输入 NLRP11型 在指定的时间点击倒感染仙台病毒（SeV）（MOI=1）的THP‐1细胞。 E类 的表达式 IFNB1公司 , ISG54， 和 ISG56标准 和 SeV磷酸蛋白 控制中的mRNA或 NLRP11型 SeV（MOI=1）感染时，通过实时PCR检测PBMC的敲除。 F类 的击倒效率 NLRP11型 通过免疫印迹分析测试PBMC中的特异性siRNA（左）。 通过ELISA检测WT或 NLRP11型 SeV（MOI=1）感染时击倒PBMC（右）。
293T细胞转染 NLRP11型 sgRNA包含抗嘌呤霉素基因，然后使用嘌呤菌素筛选三代并进行免疫印迹分析。 WT和WT中靶向DNA的序列比对和免疫印迹分析 NLRP11型 KO THP‐1电池。 THP‐1细胞被基于慢病毒的Cas9‐和 NLRP11型 特异性sgRNA（嘌呤霉素抗性）。 接下来，使用嘌呤霉素对这些细胞进行至少2周的筛选。 最后，将细胞稀释至96孔板中培养，每孔三分之一细胞，并通过免疫印迹和测序对单个细胞克隆进行评估。 293T细胞转染 NLRP11型 sgRNA，然后使用嘌呤霉素筛选三代。 接下来，293T‐ NLRP11型 将sgRNA或WT细胞与ISRE启动子报告质粒和pRL-TK质粒以及空载体或sgRNA抗性NLRP11质粒转染24 h，并在感染SeV（MOI=0.1）20 h后分析ISRE依赖性荧光素酶活性（折叠诱导）（顶部）。 用免疫印迹法检测NLRP11（底部）。 WT和 NLRP11型 KO THP‐1细胞感染HSV‐1（MOI=1）20 h，然后， 国际单项体育联合会1 , ISG54， 和 ISG56标准 通过实时PCR测定诱导率。 的表达式 TNFA公司 , IL6（IL6） mRNA输入 NLRP11型 敲除感染SeV的THP‐1细胞（MOI=1），持续指定时间点。
A、 B类 野生型（WT）和 NLRP11型 用ISRE（A）或IFN‐β（B）启动子报告质粒和pRL‐TK质粒转染敲除（KO）293T细胞24小时，然后用poly（I:C）（5μg/ml）（A）、poly（dA:dT）（5微克/毫升）转染，或感染仙台病毒（SeV）（MOI=0.1）20小时，然后进行ISRE‐或IFN∙β依赖性荧光素酶活性（折叠诱导）转染 分析。 C类 WT和 NLRP11型 在指定的时间点用SeV（MOI=1）感染KO THP‐1细胞，并通过免疫印迹分析分析总IRF3和磷酸化（p‐）IRF3。 两个印迹之间的数字分别表示磷酸化蛋白质相对于总蛋白质的密度测定。 D类 WT和 NLRP11型 用SeV（MOI=1）感染KO THP‐1细胞20小时，然后， IFNB1公司 , ISG54， 和 ISG56标准 通过实时PCR测定诱导率。 E、 F类 WT和 NLRP11型 用VSV‐eGFP（MOI=10）感染KO THP‐1细胞12 h或18 h，然后进行相位对比（PH）、荧光显微镜分析（E）和流式细胞术分析（F）。 括号线上方的数字表示VSV‐eGFP感染细胞的百分比。 比例尺，100μm。
用ISRE启动子报告质粒和pRL‐TK质粒转染293T细胞24小时后的荧光素酶活性，以及编码RIG‐I‐CARD、MDA5、MAVS、TBK1和IRF3（5D）的表达质粒，并增加NLRP11的数量。 用HA‐NLRP11和Flag‐RIG‐I、FlagMDA5、Flag-MAVS、Flag-TBK1和Flag-IRF3转染293T细胞24小时，用抗Flag珠对细胞裂解物进行免疫沉淀，然后用指示的抗体进行免疫印迹分析。 通过共免疫沉淀法分析仙台病毒（SeV）（MOI=1）感染20小时后THP‐1单核细胞中NLRP11和MAVS的相互作用。 MAVS的结构域。 括号中的数字表示结构中的氨基酸位置。 293T细胞转染Myc‐NLRP11和Flag‐MAVS、FlagMAVS-ΔCARD和Flag-MAVSΔTM 24小时，细胞裂解物用抗Flag珠进行免疫沉淀，然后用指示的抗体进行免疫印迹分析。 NLRP11的域结构。 括号中的数字表示氨基酸在结构中的位置。 293T细胞转染HA‐MAVS和Flag‐NLRP11、Flag−NLRP11-PYD、Flag-NLRP11‐NOD和Flag-NLRR 24 h，细胞裂解物用抗Flag珠进行免疫沉淀，然后用指示的抗体进行免疫印迹分析。 用ISRE启动子报告子、pRL‐TK质粒、MAVS或空载体（EV）以及编码Flag‐NLRP11‐PYD、Flag∙NLRP11-NOD或Flag▪NLRP11-LRR的表达质粒转染293T细胞24小时后的荧光素酶活性。
激活RIG‐I（CARD）‐、MDA5‐、MAVS‐，TBK1‐或IRF3（5D）介导的293T细胞中的ISRE活性。 数据表示为三个独立实验的平均值±SEM(*** P（P） <0.001与同样处理的EV转染细胞相比，Student’s t吨 ‐测试）。 将Flag‐RIG‐I‐CARD、FlagMAVS和Flag∙TBK1与空载体或Myc‐NLRP11一起转染293T细胞24小时，然后通过天然PAGE（顶部）对细胞裂解物进行IRF3二聚体分析，并通过SDS‐PAGE（底部）检测RIG‐）I‐CA RD、MAVS、TBK1和NLRP11的表达。 将Flag‐NLRP11转染293T细胞，然后在指定的时间点内感染SeV（MOI=1）。 在收获前，使用MG132处理细胞6小时。 用抗Flag珠对全细胞提取物进行免疫沉淀，然后用抗MAVS抗体进行IB分析。 用Flag‐RIG‐I和HA‐MAVS转染293T细胞，并增加NLRP11的量，转染24小时，然后用指示的抗体通过免疫共沉淀和免疫印迹分析分析细胞裂解物。 用Flag‐MAVS和HA‐Ub以及空载体或Myc‐NLRP11转染293T细胞。 免疫印迹分析MAVS的总泛素化。
用Myc‐NLRP11和Flag‐TRAF3、Flag∙TRAF5或FlagTRAF6转染293T细胞24小时，用抗Flag珠对细胞裂解物进行免疫沉淀，然后用指示的抗体进行免疫印迹分析。 仙台病毒（SeV）（MOI=1）感染20小时后，用免疫共沉淀法分析THP‐1单核细胞中NLRP11和TRAF6的相互作用。 荧光素酶活性 交通6 用ISRE启动子报告子和pRL‐TK质粒转染敲除（KO）293T细胞（底部），增加NLRP11的数量，然后感染SeV（MOI=0.1）20小时。数据表示为三个独立实验的平均值±SEM，与用相同处理的EV转染的细胞相比，Student’s t吨 测试，ns：无显著性。 中指示蛋白的免疫印迹分析 NLRP11型 THP‐1细胞过度表达，随后SeV（MOI=1）感染指定时间点（顶部）。 两个印迹之间的数字表示TRAF6相对于β-actin的密度测定。 三个独立实验被量化（底部）。 数据表示为三个独立实验的平均值±SD(** P（P） 与未感染的细胞相比<0.01，Student’s t吨 测试）。 用空载体或Myc‐NLRP11转染293T细胞12 h，感染SeV（MOI=1）12 h，然后在收获前进行MG132处理6 h。 用抗TRAF6抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，然后用指示的抗体进行免疫印迹分析。 野生型（WT）和 MAVS公司 用空载体或Myc‐NLRP11转染KO 293T细胞24小时，然后在指定的时间点用SeV（MOI=0.1）感染细胞。 用指示的抗体对细胞裂解物进行免疫印迹分析（顶部）。 两个印迹之间的数字表示TRAF6相对于β-actin的密度测定。 三个独立实验被量化（底部）。 数据表示为三个独立实验的平均值±SD(* P（P） <0.05，与未感染细胞相比，采用相同的治疗，Student’s t吨 ‐测试）。 WT和 MAVS公司 用Myc‐NLRP11和Flag‐TRAF6转染KO 293T细胞24 h，并用免疫沉淀法分析细胞裂解物。
A类 293T细胞转染对照或 交通6 siRNA转染24 h，然后用IFN‐β启动子报告质粒和pRL‐TK质粒转染12 h，并分析SeV（MOI=0.1）感染后指定时间点的IFN‐）β依赖性荧光素酶活性（折叠诱导）。 B类 转染ISRE启动子报告质粒和pRL-TK质粒的293T细胞中的荧光素酶活性，以及编码TRAF6和增加NLRP11数量的表达质粒。 C类 将Flag‐NLRP11转染293T细胞，然后在指定的时间点内感染SeV（MOI=1）。 在收获前，使用MG132处理细胞6小时。 用抗Flag珠免疫沉淀全细胞提取物，然后用抗TRAF6抗体进行IB分析。 D、 E类 转染Flag‐NLRP11或Flag∙NLRP4（D）或感染仙台病毒（SeV）（MOI=1）（E）24小时的293T细胞中HA‐TRAF6（D）和内源性TRAF6的免疫印迹分析。 F类 WT或 NLRP11型 用CHX预处理KO THP‐1细胞2 h，然后用SeV（MOI=1）感染指定时间点，然后进行免疫印迹分析。 G公司 用Myc‐NLRP11和HA‐TRAF6转染293T细胞24小时，然后用指示的抑制剂处理6小时，然后进行免疫印迹分析。 H（H） 用空载体或Myc‐NLRP11转染293T细胞12 h，感染SeV（MOI=1）12 h，然后在收获前进行MG132处理6 h。 用抗TRAF6抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，然后用指示的抗体进行免疫印迹分析。
A–C 对感染仙台病毒（SeV）（MOI=1）、转染poly（I:C）（10μg/ml）或用干扰素β（1000 U/ml）处理指定时间点的THP‐1单核细胞和HeLa细胞中NLRP11蛋白表达的免疫印迹分析。 两个印迹之间的数字表示NLRP11相对于β-actin的密度测定。 D类 用GFP‐NLRP11转染293T细胞，然后不处理（UT）或感染SeV（MOI=1）12 h，然后进行共聚焦荧光显微镜分析。 线粒体跟踪器（红色）检测线粒体。 比例尺，20μm。 E类 将HeLa细胞感染SeV（MOI=1）或不感染SeV 12 h，然后使用细胞线粒体分离试剂盒（Beyotime Biotechnology）分离线粒体，然后进行免疫印迹分析。 Tubulin和COX IV分别作为细胞溶质和线粒体标记物。
A–C NLRP11型 实时PCR分析感染仙台病毒（SeV）（MOI=1）、转染poly（I:C）（10μg/ml）或经干扰素β（1000 U/ml）处理指定时间点的THP-1单核细胞和HeLa细胞中mRNA的表达。 数据表示为三个独立实验的平均值±SEM(* P（P） < 0.05, ** P（P） <0.01，以及*** P（P） <0.001，与未经处理的细胞相比，学生的 t吨 ‐测试）。 D类 用GFP‐NLRP11转染293T细胞，然后不处理这些细胞（UT）或用poly（I:C）（5μg/ml）转染这些细胞12 h，然后进行共焦荧光显微镜分析。 线粒体跟踪器（红色）检测线粒体。 比例尺，20μm。
野生型（WT）和 NLRP11型 敲除（KO）THP‐1细胞感染VSV‐eGFP（MOI=10）24小时或不感染，然后用台盼蓝染色。 WT和 NLRP11型 用VSV‐eGFP（MOI=10）感染KO THP‐1细胞12 h，然后用碘化丙啶（PI）染色，然后进行荧光分析。 比例尺，100μm。 WT和 NLRP11型 用VSV‐eGFP（MOI=10）感染KO THP‐1细胞24 h，然后通过流式细胞仪进行PI染色分析。 对eGFP阳性（感染）细胞进行门控，以比较细胞死亡情况。 数字表示PI染色细胞的百分比（左）。 三个独立实验被量化（右）。 在VSV‐eGFP（MOI=10）感染18小时后，通过免疫印迹分析，在转染空载体或Myc‐NLRP11的293T细胞中分析分离的PARP（C‐PARP）。 野生型（WT）和 MAVS公司 用空载体或Myc‐NLRP11转染KO 293T细胞，然后用VSV‐eGFP（MOI=10）感染18 h。通过免疫印迹分析C-PARP。 在WT或 NLRP11型 VSV‐eGFP（MOI=10）感染24小时后的KO THP‐1细胞。 HT1080细胞转染 NLRP11型 siRNA或阴性对照（NC）siRNA转染48 h，然后用poly（I:C）（5μg/ml）转染24 h。收集细胞进行免疫印迹分析（左）。 三个独立实验被量化（右）。 两个印迹之间的数字表示C-PARP相对于β-actin的密度测定。 HT1080细胞转染 NLRP11型 siRNA或阴性对照（NC）siRNA转染48 h，然后用poly（I:C）（5μg/ml）转染24 h。收集细胞，通过流式细胞术进行Annexin V和PI染色分析。 用Myc‐NLRP11和 交通6 收集siRNA或阴性对照（NC）siRNA 48 h，然后用poly（I:C）（5μg/ml）转染24 h进行免疫印迹分析。 NLRP11调节功能的拟议模型。
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引用人
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