Release of HER2 repression of trefoil factor 3 (TFF3) expression mediates trastuzumab resistance in HER2+/ER+ mammary carcinoma

doi:10.18632/oncotarget.18431

.2017年6月9日；8(43):74188-74208.

doi:10.18632/目标18431。 eCollection 2017年9月26日。

释放HER2抑制三叶因子3（TFF3）表达介导HER2+/ER+乳腺癌对曲妥珠单抗的耐药性

青云冲¹, 你明亮^1 2, 维杰·潘迪¹, 阿林达姆·巴纳吉¹, 陈一军^1 2, 汉明波^1 2, 张梦怡^1 2, 兰玛^三, 陶朱^4 5, 萨隆迪·巴萨帕⁶, 梁刘^7 8, 彼得·罗比^1 2 三 9

附属公司

¹新加坡国立大学新加坡癌症科学研究所。
²新加坡国立大学林永禄医学院药理学系。
^三清华伯克利深圳学院，清华大学研究生院，中国深圳。
⁴中国科技大学合肥微尺度物理科学国家实验室和生命科学学院，安徽合肥。
⁵中国科学技术大学生命科学学院中国科学院先天免疫与慢性病重点实验室，安徽合肥。
⁶印度班加罗尔中央学院校区班加罗勒大学化学系化学生物学实验室。
⁷复旦大学肿瘤中心肿瘤系，复旦大学，中国上海。
⁸复旦大学上海肿瘤中心放射科，复旦大学，中国上海。
⁹新加坡国立大学癌症研究所。

PMID： 29088778
预防性维修识别码：项目编号：C5650333
内政部： 10.18632/目标18431

释放HER2抑制三叶因子3（TFF3）表达介导HER2+/ER+乳腺癌对曲妥珠单抗的耐药性

青云冲等。 Oncotarget公司. 2017.

.2017年6月9日；8(43):74188-74208.

doi:10.18632/oncotarget.18431。 eCollection 2017年9月26日。

作者

附属公司

¹新加坡国立大学新加坡癌症科学研究所。
²新加坡国立大学林永禄医学院药理学系。
^三清华伯克利深圳学院，清华大学研究生院，中国深圳。
⁴中国科技大学合肥微尺度物理科学国家实验室和生命科学学院，安徽合肥。
⁵中国科学技术大学生命科学学院中国科学院先天免疫与慢性病重点实验室，安徽合肥。
⁶印度班加罗尔中央学院校区班加罗勒大学化学系化学生物学实验室。
⁷复旦大学肿瘤中心肿瘤系，复旦大学，中国上海。
⁸复旦大学上海肿瘤中心放射科，复旦大学，中国上海。
⁹新加坡国立大学癌症研究所。

PMID： 29088778
预防性维修识别码：项目编号：C5650333
内政部： 10.18632/目标18431

摘要

HER2+/ER+乳腺癌是管腔B亚型的一个子集，约占所有乳腺癌的10%。HER2+/ER+乳腺癌中HER2和雌激素受体（ER）之间的双向串扰导致对抗雌激素和HER2靶向治疗的耐药性。TFF3促进乳腺癌的进展，并与乳腺癌中的抗雌激素抵抗有关。在此，我们研究了HER2和雌激素反应性TFF3之间的交叉调节，以及TFF3在介导HER2+/ER+乳腺癌中曲妥珠单抗耐药中的作用。在HER2+/ER+乳腺癌细胞中，TFF3的表达通过HER2激活而降低，通过用曲妥珠单抗抑制HER2而增加，部分呈ERα非依赖性。相反，TFF3的强制表达激活了受体酪氨酸激酶（HER1-4）的整个HER家族。因此，HER2通过对TFF3的转录抑制负调控其自身的信号传导，而曲妥珠单抗对HER2的抑制导致TFF3表达增加，以弥补HER2信号传导的缺失。在获得性曲妥珠单抗耐药的HER2+/ER+乳腺癌细胞中，TFF3表达显著上调，并与HER信号的相应降低相关。siRNA介导的TFF3耗竭或小分子抑制降低了trastuzumab耐药细胞的生存和生长优势，而没有对trastuzhumab重新敏感。此外，TFF3抑制消除了对曲妥珠单抗耐药的HER2+/ER+乳腺癌细胞中增强的癌干细胞样行为。总之，TFF3可能是曲妥珠单抗耐药HER2+/ER+乳腺癌的潜在生物标志物和治疗靶点。

关键词：HER2；乳腺癌；雌激素受体；曲妥珠单抗耐药性；三叶因子3。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突PEL和TZ之前曾咨询过Perseis Therapeutics Ltd.。PEL也在PCT申请号WO/2006/69253、WO/2008/042435、WO/2009/147530和WO/2012/150869中命名，以及这些应用的衍生产品/国家阶段组件。VP、B和PEL将被指定为小分子抑制TFF3的临时专利申请的发明人。QYC、MLY、AB、YJC、HMP、MZ、LM和LL声明没有利益冲突。

数字

**图1。HER2的激活降低了TFF3的表达，而HER2的抑制部分以ERα非依赖性的方式增加了BT474细胞的TFF3表达**
(A类–C）左侧用500 ng/ml EGF或HRG分别处理BT474细胞24小时和48小时，在无酚培养基中添加10%炭样剥离FBS。（A–C）赖特在100 nM 17β-雌二醇存在下，用200 ng/ml EGF或HRG在无酚培养基中处理BT474细胞48小时，该培养基补充有10%煤焦状FBS。(D类–F类)用10µg/ml曲妥珠单抗在无酚培养基中处理BT474细胞48小时，该培养基补充有10%炭化裂解FBS±100 nM 17β-雌二醇。以Renilla荧光素酶活性作为转染对照，测定（A和D）TFF3启动子荧光素素酶活性。以β-肌动蛋白为输入对照，分别用qPCR和western blot检测TFF3（B和E）mRNA和（C和F）蛋白水平。使用ImageJ进行蛋白质带的密度分析。(克和**H（H）**)用10µg/ml曲妥珠单抗±100 nM 17β-雌二醇±1µM他莫昔芬在添加10%炭样剥离FBS的无酚培养基中处理BT474细胞48小时。以Renilla荧光素酶活性作为转染对照，测量（g）ERE和（H）TFF3启动子荧光素素酶活性。UT：未经处理；E2:17β-雌二醇；Tras：曲妥珠单抗；Tam：三苯氧胺；ERE：雌激素反应元件*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001; NS，无显著性。

**图2。TFF3的强制表达激活了HER信号活性，而AMPC抑制TFF3降低了BT474细胞的HER信号活动**
(A类)生成BT474-VEC和-TFF3细胞。(B类)用指定浓度的TFF3抑制剂AMPC在添加5%FBS的培养基中处理BT474细胞。随后，用western blot分析TFF3、磷酸化和总HER受体以及下游信号介质的水平。β-肌动蛋白被用作输入对照。使用ImageJ进行蛋白质条带的密度测定分析。(C类)激活的HER2降低了TFF3的表达，这反过来又降低了负反馈回路中TFF3介导的HER2信号传导的激活。(D类)曲妥珠单抗对HER2的抑制增加了TFF3的表达，以补偿HER2信号传导的损失。

**图3。在曲妥珠单抗存在下，TFF3的强制表达增加，而AMPC抑制TFF3可降低HER2+/ER+乳腺癌细胞的3D Matrigel生长**
(A类)BT474-VEC和-TFF3细胞在含有4%Matrigel的5%FBS培养基中培养，并用指定浓度的曲妥珠单抗处理8至10天。通过AlamarBlue分析测定3D Matrigel中的细胞活力。(B类)BT474细胞在含有4%Matrigel的5%FBS培养基中培养，并用AMPC（IC）处理₅₀三维生长条件下BT474细胞中≈2µM）±10µg/ml曲妥珠单抗，持续8至10天。通过AlamarBlue分析测定3D Matrigel中的细胞活力。(C类)MDA-MB-361细胞在含有4%Matrigel的10%FBS培养基中培养，并用AMPC（IC）处理₅₀三维生长条件下MDA-MB-361细胞中≈5µM）±10µg/ml曲妥珠单抗，持续8至10天。通过AlamarBlue分析测定3D Matrigel中的细胞活力。Tras：曲妥珠单抗；载体：AMPC的DMSO溶剂。比例尺：200µm*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001; NS，无显著性。

**图4。与对照细胞相比，抗曲妥珠单抗的BT474细胞中TFF3高度上调，而HER信号显著降低**
(A类)在添加5%FBS的培养基中，用指定浓度的曲妥珠单抗处理对照和曲妥珠抗BT474细胞，为期6天。用AlamarBlue法测定细胞活力。TFF3型(B类)mRNA和(C类)以β-肌动蛋白为输入对照，通过qPCR和western blot检测对照和曲妥珠单抗耐药BT474细胞的蛋白水平。(D类)用DMSO载体或20µM AMPC在补充有5%FBS的培养基中处理对照和曲妥珠单抗耐药的BT474细胞24小时。使用western blot分析对照和曲妥珠单抗抗性细胞中磷酸化和总HER受体及下游信号介体的水平。β-肌动蛋白被用作输入对照。使用ImageJ进行蛋白质带的密度分析。Ctrl或C：控制单元格；Tras-Res或TR：曲妥珠单抗耐药细胞；Tras：曲妥珠单抗；载体：AMPC的DMSO溶剂*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001; NS，无显著性。

**图5。与对照细胞相比，抗曲妥珠单抗MDA-MB-361细胞中TFF3上调，而HER信号降低**
(A类)对照组和耐曲妥珠单抗的MDA-MB-361细胞在添加10%FBS的培养基中用指定浓度的曲妥珠单抗处理6天。通过AlamarBlue测定法测定细胞活力。TFF3型(B类)信使核糖核酸和(C类)以β-肌动蛋白为输入对照，通过qPCR和western blot检测对照组和曲妥珠单抗耐药MDA-MB-361细胞的蛋白水平。(D类)用DMSO载体或20µM AMPC在添加10%FBS的培养基中处理对照组和曲妥珠单抗耐药MDA-MB-361细胞24小时。用western blot分析对照组和曲妥珠单克隆抗体耐药细胞中磷酸化和总HER受体及下游信号介体的水平。β-肌动蛋白被用作输入对照。使用ImageJ进行蛋白质带的密度分析。Ctrl或C：控制单元格；Tras-Res或TR：曲妥珠单抗耐药细胞；Tras：曲妥珠单抗；载体：AMPC的DMSO溶剂*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001; NS，无显著性。

**图6。TFF3的缺失表达降低了对曲妥珠单抗耐药的BT474细胞的3D Matrigel生长，而没有对曲妥珠单抗重新敏感**
(A类)用所示浓度的打乱或TFF3 siRNA瞬时转染对照细胞和抗曲妥珠单抗的BT474细胞。以β-肌动蛋白作为输入对照测定TFF3蛋白水平。(B类)用打乱或TFF3 siRNA转染的对照和曲妥珠单抗耐药BT474细胞在含有4%基质凝胶的5%FBS培养基中培养，并用10µg/ml曲妥珠单抗处理8至10天。通过AlamarBlue测定法测量3D基质凝胶中的细胞活力。Ctrl：控制单元格；Tras Res：曲妥珠单抗耐药细胞。比例尺，200µm*第页< 0.05; NS，无显著性。

**图7。AMPC对TFF3的抑制降低了对曲妥珠单抗耐药的BT474细胞的单层细胞存活率，增加了细胞凋亡，并降低了3D Matrigel生长，但未对曲妥珠单抗重新敏感**
(A类)用10µM和20µM的AMPC在添加5%FBS的培养基中处理对照细胞和抗曲妥珠单抗的BT474细胞24小时。用β-肌动蛋白作为输入对照测定TFF3蛋白水平。对照组和耐曲妥珠单抗的BT474细胞在补充有5%FBS的培养基中用指定浓度的AMPC±10µg/ml曲妥珠单抗处理(B类)6天后用AlamarBlue法测定细胞活力。(C类)24小时后测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7活性。(D类)对照组和抗曲妥珠单抗的BT474细胞在含有4%基质凝胶的5%FBS培养基中培养，并用指定浓度的AMPC±10µg/ml曲妥珠单抗处理8至10天。通过AlamarBlue分析测定3D Matrigel中的细胞活力。AMPC处理的细胞与载体处理的细胞相比，细胞活力差异的统计显著性用*符号表示，而曲妥珠单抗处理的细胞和未处理的细胞之间的差异用#符号表示。C或Ctrl：控制单元格；TR或Tras-Res：曲妥珠单抗耐药细胞；载体：AMPC的DMSO溶剂。比例尺，200µm*第页< 0.05; ** 或^##第页< 0.01; *** 或^###第页< 0.001; NS，无显著性。

**图8。曲妥珠单抗耐药的BT474细胞表现出更高的癌症干细胞样行为，这被AMPC对TFF3的抑制所消除**
(A类)对照组和抗曲妥珠单抗的BT474细胞接种在乳腺生长介质中的超低附着板中，并用指定浓度的AMPC处理。10天后，用AlamarBlue测量乳房的生长。显示了生成的具有代表性的乳房球体图像。比例尺，200µm。(B类)对照组和耐曲妥珠单抗的BT474细胞在添加5%FBS的培养基中用曲妥珠单抗或AMPC或其组合处理4天。然后收集细胞并与ALDEFLOUR底物（BAAA，BODIPY）孵育^®-氨基乙醛）定义ALDH1阳性人群。ALDH1的特异性抑制剂二乙氨基苯甲醛（DEAB）用于建立基线荧光。流式细胞仪图显示侧面散射（SSC）与荧光强度。Ctrl：控制单元格；Tras-Res：曲妥珠单抗耐药细胞；载体：AMPC的DMSO溶剂**第页< 0.01; ***第页< 0.001.

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1. Parise CA，Caggiano V.根据ER/PR/HER2亚型和根据肿瘤分级和免疫组织化学生物标记物的替代分类确定的乳腺癌生存率。癌症流行病学杂志。2014;2014:469251.-项目管理咨询公司-公共医学
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