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.2017年9月5日；8(43):73516-73528.
doi:10.18632/目标20640。 eCollection 2017年9月26日。

OPMD中的选择性多聚腺苷化形成功能异常转录物

韦里德·拉兹 1, 乔治·迪克森 2, Peter A C’t Hoen（彼得·A·C’t霍恩） 1
附属机构

OPMD中的选择性多聚腺苷化形成功能异常转录物

韦里德·拉兹等。 Oncotarget公司. .

摘要

转录物3'非翻译区（UTR）的转录后mRNA处理改变mRNA景观。3'-UTR中的替代性聚腺苷酸化（APA）利用通常导致3'-UTRA缩短，从而影响mRNA稳定性，该过程受PABPN1调节。在骨骼肌中，PABPN1水平随着年龄的增长而降低，在眼咽肌营养不良（OPMD）中下降幅度更大。OPMD是一种由PABPN1扩张突变引起的迟发常染色体显性肌病。在OPMD模型中，3'-UTR中多聚腺苷酸化位点的利用从远端转移到近端，PABPN1在APA中起着重要作用。PABPN1介导的APA转录物是否具有功能尚不完全清楚。我们研究了OPMD模型中转录物的核输出和翻译效率。我们重点研究了功能性PABPN1降低的细胞模型中APA利用的自噬调节基因（ATG）。我们提供证据表明，来自远端PAS的ATG转录物保留在细胞核中，从而降低了PABPN1减少的细胞的翻译效率。相反，近端PAS的转录物显示出较高的细胞质丰度，但核糖体的占有率降低。因此，我们认为，在PABPN1水平降低的情况下，来自APA的ATG转录物可能无法有效转化为蛋白质。在这些条件下，我们发现组成性自噬体融合和减少自噬流量。PABPN1的增强恢复了自噬体融合，表明PABPN1介导的APA在OPMD和衰老肌肉的自噬中起作用。

关键词：Gerotarget；PABPN1；衰老肌肉；选择性聚腺苷化位点；自噬；mRNA处理。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突所有作者均声明无利益冲突。

数字

图1
图1。OPMD小鼠模型中ATGs mRNA的表达，A17.1
答-答。条形图显示了A17.1（灰条）和FVB对照小鼠EDL（A）或Soleus（B）肌肉中八个ATG的RT-qPCR实验结果。通过归一化计算表达倍数变化Hprt（小时）家政基因和FVB控制。C、。3’UTR中PAS利用的PCR分析示意图。使用了两组引物：一组远端引物（D）扩增远端PAS的长转录物，另一组近端引物（P）扩增近端PAS的短转录物。APA利用率是根据距离与接近的比率计算得出的。D。条形图显示EDL中五个ATG的远侧与近侧比率。平均值和标准偏差来自五只老鼠。学生的T检验用于评估统计显著性（0.05<第页<0.01 (*); 0.01<第页<0.005（**）P（P）<0.005 (***).
图2
图2。Pabpn1通过改变PAS利用和核输出调节ATG表达，影响翻译和蛋白质丰度
在正常生长条件下，在稳定的加扰控制shRNA（scra）或Pabpn1-shRNA（shPab）转染的C2C12小鼠成肌细胞培养物中进行实验。答：。条形图显示ATG mRNA折叠变化。在标准化后计算折叠变化Hprt（小时）家政基因和对照培养物。使用近端引物集获得Ct值。B。条形图显示了五个ATG的远端引物和近端引物组的产物之间的比率。C、。细胞质和细胞核组分蛋白裂解物的Western blot分析。Gapdh标记细胞质部分，LaminA标记核部分。D。条形图显示了scra或shPab细胞培养中细胞核和细胞溶质组分之间远端引物集或近端引物集的转录物丰度。Hprt（小时）显示为未改变的参考基因。E.公司。条形图显示了SCR或shPab细胞培养中核糖体结合组分中远端引物的转录物富集。Hprt（小时）显示为未更改的引用。F、。图中显示了来自紧急停堆或shPab C2C12细胞培养物的Pabpn1、Atg3、Lc3和Wipi1的典型蛋白质印迹。Gapdh用作加载控制。G.公司。条形图显示了紧急停堆和shPab细胞培养物之间的蛋白质积累比率（Atg5、Lc3a和Wipi1）。蛋白质丰度标准化为Gapdh负荷控制。H。用于从PABPN1复合物中分离RNA的PABPN1免疫沉淀（IP）的蛋白质印迹分析。用PABPN1抗体进行IP试验，仅用珠子进行对照。以抗PABPN1抗体和微管蛋白作为负荷对照进行免疫印迹。一、。条形图显示了SCR或shPab细胞培养中远端引物集或近端引物集转录物的RNA-IP富集。通过输入和Hprt（小时）平均值和标准偏差来自三个生物复制。学生的T检验用于评估统计显著性（0.05<第页<0.01 (*); 0.01<第页<0.005 (**)P（P）<0.005 (***).
图3
图3。PABPN1可用性降低会损害人类肌肉细胞培养中的自噬
对照组（H1）或PABPN1下调型（shPAB）人成肌细胞培养物在正常营养条件（20%FBS）下培养。用HBSS进行应激饥饿3小时或0.5%HS进行应激饥饿2天。答：。代表性的蛋白质印迹显示PABPN1、LC3I和LC3II（分别为18和16kDa）、WIPI1和GAPDH或微管蛋白负载对照的积累。B。条形图显示LC3II积累或LC3II/LC3I比率的量化。蛋白质水平标准化为GAPDH。C、。典型的Western blot显示了饥饿胁迫培养物中LC3和GAPDH的负载控制。D。条形图显示了shPAB或对照细胞培养物中LC3II积累或LC3II/LC3I比率的定量。蛋白质水平标准化为GAPDH。在正常生长条件下培养物的折叠变化显示在每个条的上方。E.公司。代表性实验的Western blot显示，在20μM氯喹（CQ）处理的细胞培养物中，LC3和Tubulin蛋白积累F、。典型图像显示H1对照或shPab细胞培养物中的LC3点（绿色）。细胞核显示为灰色。比例尺为10µm。下部面板显示了用PABPN1-CFP（Ala10-CFP）转化后shPAB细胞的代表性图像。Ala10-CFP以青色表示。比例尺为7.5µm。G.公司。条形图显示了每个核平均LC3点的量化。H。条形图显示LC3的平均荧光强度（MFI）的点状平均值。每次分析中的核数在X轴下表示。一、。-J。条形图显示了正常生长条件（NGS）或饥饿胁迫下H1对照（I）和shPAB（J）培养物中ATG转录物的表达。归一化后计算折叠变化高效放射治疗在正常营养条件下进行基因管理和对照培养。标准差和平均值来自三个独立的生物学实验。学生T检验用于评估统计显著性（0.05<p<0.01（*）；0.01<第页< 0.005 (**)P（P）< 0.005 (***).
图4
图4。OPMD肌肉细胞模型中自噬过度激活
实验在稳定的肌肉细胞培养中进行，过度表达野生型PABPN1（A10）或exp型PABPN1（A17）。用2%HS培养诱导PABPN1转基因表达。答：。Western blot显示转基因A10和A17 PABPN1-FLAG（55 kDa）和内源性PABPN1（52 kDa。自噬激活由LC3II和P62表示。Tubulin和Gapdh用作加载控制。B。细胞培养物中含有抗FLAG（绿色）和抗LC3（红色）抗体的代表性免疫荧光图像，与2%HS孵育3小时或48小时。比例尺为10µm。C、。图表栏显示A10或A17培养基中每个细胞核的平均LC3点。平均值和标准偏差来自从三个独立实验中收集的100个细胞核。D。条形图显示了A10或A17培养物中五种ATG的mRNA水平。在归一化至Hprt（小时）家政基因与亲代培养。E.公司。条形图显示了来自远端引物组的ATG转录物的核与胞质比例。F、。图中显示了核和细胞溶质部分的典型蛋白质印迹，分别以Emerin或Tubulin标记。G.公司。条形图显示了A10或A17细胞培养物中细胞核或细胞溶质部分PABPN1的丰度。将每个组分归一化至负荷控制后，计算PABPN1丰度。平均值和标准偏差来自4个重复。平均值和标准偏差来自三种生物独立培养物。通过学生T检验评估统计显著性(第页<0.05用*表示；第页<0.005用**表示）。
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