In vivo and ex vivo methods of growing a liver bud through tissue connection

doi:10.1038/s41598-017-14542-2

.2017年10月26日；7(1):14085.

doi:10.1038/s41598-017-14542-2。

通过组织连接生长肝芽的体内和离体方法

附属公司

¹九州大学医学科学研究生院儿科外科、生殖与发育医学系，地址：日本福冈市东区麦大石3-1-1号，邮编：812-8582。
²日本佐贺大学医学院再生医学与生物医学工程系，佐贺县本泽町1号，邮编840-8502。nakayama@me.saga-u.ac.jp。
^三庆应义塾大学医学院器官制造系，35 Shinanomachi，Shinjuku，Tokyo，160-8582，Japan。
⁴Cyfuse Biomedical K.K.，2-27-17Hongo，Bunkyo-ku，东京，113-0033，日本。
⁵九州大学医学研究生院病理学解剖病理学系，地址：日本福冈市东町麦大石3-1-1号，邮编：812-8582。
⁶九州大学口腔科学研究生院分子细胞生物学和口腔解剖系，日本福冈市东町麦大石3-1-1号，邮编812-8582。
⁷庆应义塾大学医学院器官制造系，35 Shinanomachi，Shinjuku，Tokyo，160-8582，Japan。organfabri@a2.keio.jp。

PMID： 29074999
预防性维修识别码：项目编号：5658340
内政部： 10.1038/s41598-017-14542-2

通过组织连接生长肝芽的体内和体外方法

柳木由介等人。科学代表. 2017.

.2017年10月26日；7(1):14085.

doi:10.1038/s41598-017-14542-2。

附属公司

¹九州大学医学科学研究生院儿科外科、生殖与发育医学系，地址：日本福冈市东区麦大石3-1-1号，邮编：812-8582。
²日本佐贺大学医学院再生医学与生物医学工程系，佐贺县本泽町1号，邮编840-8502。nakayama@me.saga-u.ac.jp。
^三庆应义塾大学医学院器官制造系，35 Shinanomachi，Shinjuku，Tokyo，160-8582，Japan。
⁴Cyfuse Biomedical K.K.，2-27-17Hongo，Bunkyo-ku，东京，113-0033，日本。
⁵九州大学医学研究生院病理学解剖病理学系，地址：日本福冈市东町麦大石3-1-1号，邮编：812-8582。
⁶九州大学口腔科学研究生院分子细胞生物学和口腔解剖学系，3-1-1 Maidashi，Higashi ku，Fukuka，812-8582，日本。
⁷庆应义塾大学医学院器官制造系，35 Shinanomachi，Shinjuku，Tokyo，160-8582，Japan。organfabri@a2.keio.jp。

PMID： 29074999
预防性维修识别码：项目编号：5658340
内政部： 10.1038/s41598-017-14542-2

摘要

细胞疗法被提议作为原位肝移植的替代方案。新的移植玻璃体生成的肝芽可能具有治疗潜力。体内和体外培养肝芽的方法对于肝芽移植的临床转化至关重要。我们在此报道了一种用于体内生长的肝芽的新移植方法，该方法涉及在横切的肝实质上原位移植，与异位移植相比，该方法显示出长的植入和显著的生长。此外，本研究还展示了一种通过使用3D生物打印机融合数百个肝芽状球体来快速制造可缩放肝样组织的方法。其通过针线阵列系统固定3D组织形状的系统能够制造出精细的几何形状，并在3D打印后立即执行培养循环，从而避免了体外缺血环境。体外构建的人肝样组织在体外表现出自组织性，并在裸鼠肝脏上植入。这些成就最终显示了在体内和体外培养的方法在体外生成的肝芽中生长。这些方法为体外生成的肝器官移植提供了一种新的途径。

PubMed免责声明

利益冲突声明

K.Nakayama是Cyfuse Biomedical KK的联合创始人和股东。以及Bio-3D打印机专利中指定的发明人/开发商。专利名称：细胞三维结构的制备方法；专利号：JP4517125。专利名称：细胞结构生产装置；专利号：JP5896104。T.Tamura受雇于Cyfuse Biomedical KK。E.Kobayashi是Regience K.K.的特别顾问。Regience K。K.是肝芽移植专利的申请人。专利名称：再生肝器官药物产品；专利申请号：JP2015-095829。

数字

图1
组织移植策略示意图。使用3D生物打印机构建可伸缩的肝样组织，并将其移植到横切的肝实质上。

图2
肝组织移植新方法的发展。(一)用超声波激活装置对自然肝脏进行大体观察。移植床坏死，退化为黄色组织。虚线表示移植的肝组织。(b条)自然肝脏烧伤部位的HE染色横截面。虚线表示移植的工程肝组织和天然肝烧伤部位之间的边界。实线表示天然肝脏的烧伤部位和天然肝脏的正常区域之间的边界。比例尺，200μm。(**c（c）**)体内将肝芯片移植到横断的肝实质上的生物发光成像显示了肝芯片的植入。(d日)体内移植到肝脏表面裂缝中的肝脏芯片的生物发光成像。未实现肝芯片的植入。(**e（电子）**)移植肝芯片之间边界的HE染色横截面。观察到血管闭塞（箭头）。(**（f）**)移植的肝芯片上塞满了血块。比例尺，100μm in(**b、 e、f**).

图3
将组织移植到受体大鼠肝脏横断的实质上的方法。(**a、 b条**)用外科缝线横断正中叶的肝实质，同时安全结扎血管，在横断平面上形成完整的肝实质。(**c（c）**)肝组织附着在中叶横断的实质上(d日)用胶原蛋白片覆盖。

图4
肝芽移植于横断的实质与肠系膜。(一)从荧光素酶转基因大鼠胚胎中获取的肝芽。(b条)在横断的肝实质上进行原位移植。(**c（c）**)近端肠系膜异位移植。灰色箭头表示移植的肝芽。(d日)体内正交异性和异位移植后移植物的生物发光成像。原位移植：灰方，n = 3.异基因移植：黑十字，n = 4.结果代表平均值 ± 标准偏差(**e、（f）**)90年代移植肝芽的HE染色切片^第个第二天(**e（电子）**)异位和(**（f）**)原位移植。(**e（电子）**)恒星显示假腺体结构。(**（f）**)虚线表示移植的肝芽。观察到成熟的肝细胞样细胞。箭头表示血管。比例尺，100μm。

图5
建立合适的培养条件以产生大量的肝芽状球体。(一)显微镜下观察不同比例hHeps和HUVEC下球体的形成。hHeps，黑色；HUVEC，红色(**b、 c（c）**)不同hHeps和hMSCs比例下异球状体形成的形态学分析。(b条)球状体形成的微观观察。hMSCs的加入显著促进了肝细胞聚集，并在2天内生成单个球体。(**c（c）**)不同比例的hHeps和hMSCs的异球状体的圆度。结果代表平均值 ± SD；n个 = 12. (d日)圆度为的球体的比率 ≥ 不同比例的hHeps、HUVEC和hMSCs为60%；n个 = 16. (**e（电子）**)用ELISA法测定培养基中白蛋白的分泌。含有hHeps、HUVECs和hMSCs的LBS以10:7:3的比例显示白蛋白分泌水平显著最高。结果代表平均值 ± SD；n个 = 8. (**（f）**)优化球体的轮廓（hHeps:HUVECs:hMSCs，10 × 10^三:7 × 10^三:3 × 10^三细胞）。球体直径和圆度的变化以及圆度为 ≥ 60%. 结果代表平均值 ± SD；n个 = 16. (克)使用三种细胞类型（hHeps：黑色；HUVEC：红色；MSCs：绿色）的混合物对球体形成进行微观观察。比例尺，300μm。

图6
使用新型3D生物打印机构建可伸缩的肝样组织。(一)带或不带间距的管状结构的比较设计。(b条)三维组织构建过程中的形态学变化。比例尺，200μm。(**c（c）**)HE染色横截面中间距对7^第个文化日。(d日)实时RT-PCR分析肝基因表达谱mRNA在原代肝细胞（PH）、肝芽样球体（LBS）中的表达^第培养第天，第5天的三维肝组织^第个培养日（移植日）。n个 = 所有组为3*P（P） < 0.05，**P < 0.01和***P < 0.005之间。ns：无意义。图形栏显示平均值 ± SD.细胞角蛋白18:CK18，酪氨酸转氨酶：TAT，肝细胞核因子4α：HNF4a，Tdo2色氨酸2,3-双加氧酶：Tdo2，胆固醇7α-羟化酶：CYP7A1，白蛋白：Alb(**e（电子）**)通过ELISA测定的有/无培养循环的生物制品组织中白蛋白分泌的比较。循环（+），n = 4; 循环（−），n = 3.结果代表平均值 ± 标准偏差*对 < 0.05.

图7
组织学分析体外-人造肝样组织。(**a、 b、c**)通过苏木精-伊红染色、Masson三色染色和使用抗人CD31抗体的免疫染色对针头上的结构进行组织学分析（3D打印后3天）。(b条)在组织构建过程中，细胞自产ECM。(**c（c）**)HUVEC（箭头所示）覆盖在组织表面。(**d、 e（电子）**)7号飞机肝脏样组织的荧光图像^第个文化日。hHep用抗人白蛋白抗体（绿色）染色，HUVEC用抗人CD31抗体（红色）染色。证实了hHeps产生白蛋白和在肝样组织内形成网状内皮网络。比例尺，200μm。(**（f）**)7号公路的HE型横截面^第个文化中的一天。肝细胞是活的，即使在组织中心，其厚度约为600μm。比例尺，100μm。(克)24例患者肝样组织的免疫染色^第个文化日。CK19-阳性细胞和导管样形态。箭头表示CK19阳性细胞具有导管样形态。比例尺，200μm。(小时)肝样组织中胆管样结构的荧光图像。

图8
移植体外-在横切的肝实质上制作肝样组织。(**a、 b条**)一种移植的类似肝脏的组织移植。(**c（c）**–**e（电子）**)移植后第7天移植物的组织学分析。(**c（c）**)通过人CD31的免疫染色鉴定了HUVEC的血管形成（箭头所示）。虚线表示大鼠肝脏的边界。比例尺，100μm。(d日)通过人白蛋白的免疫染色检测移植物中hHeps产生的人白蛋白。比例尺，200μm。(**e（电子）**)移植物中人CYP3A4免疫染色阳性。比例尺，200μm。(**（f）**)用ELISA法测定大鼠血清中的人白蛋白水平。(小时)28号公路的HE型横截面^第个移植后第天。在受体肝脏100μm范围内观察到hHeps。移植肝细胞出现棕色色素沉着。色素是脂褐素。比例尺，100μm。(克)通过移植物纤维组织中的免疫染色鉴定出人CK19阳性细胞（箭头所示）。比例尺，100μm。

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1. Zarinpar A，Busuttil RW。肝移植：过去、现在和未来。Nat.Rev.胃肠病学。肝素。2013;10:434–440. doi:10.1038/nrgool.2013.88。-内政部-公共医学
1. 福布斯SJ等，《肝脏疾病的细胞治疗：从肝移植到细胞工厂》。《肝素杂志》。2015;62:S157–S169。doi:10.1016/j.jhep.2015.02.040。-内政部-公共医学
1. Matas AJ等。肝细胞移植治疗代谢缺陷：Gunn大鼠血浆胆红素降低。西恩斯。1976;192:892–894. doi:10.1126/science.818706。-内政部-公共医学
1. Fox IJ等。肝细胞移植治疗Crigler-Najjar综合征I型。北英格兰。《医学杂志》，1988年；338:1422–1426。doi:10.1056/NEJM199805143382004。-内政部-公共医学
1. Enosawa S等。使用活体供体减少移植肝细胞移植治疗鸟氨酸转氨酶缺乏症婴儿：肝细胞的新来源。肝脏移植。2014;20:391–393. doi:10.1002/lt.23800。-内政部-公共医学

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[1] Zarinpar A，Busuttil RW。肝移植：过去、现在和未来。Nat.Rev.胃肠病学。肝素。2013;10:434–440. doi:10.1038/nrgool.2013.88。-内政部-公共医学

[2] Zarinpar A，Busuttil RW。肝移植：过去、现在和未来。Nat.Rev.胃肠病学。肝素。2013;10:434–440. doi:10.1038/nrgool.2013.88。-内政部-公共医学

[3] 福布斯SJ等，《肝脏疾病的细胞治疗：从肝移植到细胞工厂》。《肝素杂志》。2015;62:S157–S169。doi:10.1016/j.jhep.2015.02.040。-内政部-公共医学

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[5] Matas AJ等。肝细胞移植治疗代谢缺陷：Gunn大鼠血浆胆红素降低。西恩斯。1976;192:892–894. doi:10.1126/science.818706。-内政部-公共医学

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[8] Fox IJ等。肝细胞移植治疗Crigler-Najjar综合征I型。北英格兰。《医学杂志》，1988年；338:1422–1426。doi:10.1056/NEJM199805143382004。-内政部-公共医学

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[10] Enosawa S等。使用活体供体减少移植肝细胞移植治疗鸟氨酸转氨酶缺乏症婴儿：肝细胞的新来源。肝脏移植。2014;20:391–393. doi:10.1002/lt.23800。-内政部-公共医学

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