Acylated and unacylated ghrelin inhibit atrophy in myotubes co-cultured with colon carcinoma cells

doi:10.18632/oncotarget.20531

.2017年8月24日；8(42):72872-72885.

doi:10.18632/目标20531。 eCollection 2017年9月22日。

酰化和非酰化ghrelin抑制与结肠癌细胞共培养的肌管萎缩

曾贤良¹, Sizeng Chen公司¹, 杨扬¹, 赵珂¹

附属公司

PMID： 29069832
预防性维修识别码：下午564175
内政部： 10.18632/目标20531

酰化和非酰化ghrelin抑制与结肠癌细胞共培养的肌管萎缩

曾贤良等。 Oncotarget公司. 2017.

.2017年8月24日；8（42）：72872-72885。

doi:10.18632/目标20531。 eCollection 2017年9月22日。

作者

曾贤良¹, Sizeng Chen公司¹, 杨扬¹, 赵珂¹

附属

¹福建医科大学第一附属医院消化外科，福建福州350005。

PMID： 29069832
预防性维修识别码： PMC5641175
内政部： 10.18632/目标20531

摘要

癌症恶病质是蛋白质降解增加和蛋白质合成减少的结果。多功能循环激素ghrelin促进肌肉蛋白质的合成并抑制其降解，但其作用机制尚不完全清楚。在此，我们研究了C2C12肌管与CT26结肠癌细胞共培养是否会导致肌管萎缩，以及酰化ghrelin（AG）和非酰化ghgrein（UnAG）是否具有抗萎缩作用。我们发现共同培养会导致肌管萎缩，并增加培养液中肿瘤坏死因子α（TNF-α）和肌抑制素的浓度。此外，共培养下调了肌生成素和MyoD的表达，抑制了Akt信号传导，上调了泛素E3连接酶的表达，激活了肌管中的钙蛋白酶系统和自噬。AG和UnAG都抑制了这些变化。我们的研究描述了一部小说在体外该模型可用于研究癌症恶病质，我们的研究结果表明AG和UnAG可能用于治疗癌症恶病症。

关键词：钙蛋白酶；癌症恶病质；共生；ghrelin；肌管。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。AG/UnAG防止共同培养的肌管破裂**
**（A）**C2C12肌管（×100）中抗肌球蛋白重链（MHC）抗体的免疫荧光染色。MHC染色勾勒出肌管轮廓（绿色）。用4′6-二氨基-2-苯基吲哚染色细胞核（蓝色）。**（B）**肌管直径表示为阴性对照的%。CO组和任何NC组之间存在显著差异(^#在CO组和CO+AG/UnAG组之间（*P<0.001），采用单因素方差分析，然后进行Tukey检验。**（C）**C2C12肌管中MHC mRNA的水平。mRNA水平归一化为GAPDH，并表示为阴性对照的倍数变化。NC组和CO组之间存在显著差异(^#P<0.001），CO组和CO+AG/UnAG组之间（*P=0.044，P=0.001；分别），采用单因素方差分析，然后进行Dunnett的T3测试。**（D）**C2C12肌管中MHC2、MHC7和GAPDH的Western blot。**（E）**MHC2的量化标准化为GAPDH。CO组和任何NC组之间存在显著差异(^#P=0.001，P<0.001；分别为P=0.001），在CO和CO+AG/UnAG组之间（*P<0.001，P=0.015；分别），通过单因素方差分析和Tukey检验。**（F）**MHC7的定量标准化为GAPDH。CO组和任何NC组之间存在显著差异(^#P=0.004，P=0.001；分别为P=0.047），在CO组和CO+AG/UnAG组之间（*P=0.035，P=0.026；分别），采用单向方差分析，然后进行Tukey检验。数据表示为平均值±标准偏差。比例尺表示100μm。

**图2。细胞培养基中前趋化因子的浓度**
**（A）**共培养液中TNF-α浓度的ELISA检测。CO组和任何NC组之间存在显著差异(^#在CO组和CO+AG/UnAG组之间（*P<0.001），采用单因素方差分析，然后进行Tukey检验。**（B）**共培养液中IL-1β浓度的ELISA检测。通过单因素方差分析和Tukey检验，六组之间未发现显著差异。**（C）**ELISA检测共培养液中的肌抑制素浓度。CO组和任何NC组之间存在显著差异(^#P<0.001），CO组和CO+AG/UnAG组之间（分别为*P=0.001，P<0.001），采用单因素方差分析，然后进行Tukey检验。数据表示为平均值±SD。

**图3。AG/UnAG改善共同培养的肌管中的肌生成前转录因子**
**（A）**C2C12肌管中肌生成素、MyoD和GAPDH的Western blot。**（B）**肌生成素的定量按照GAPDH标准化。CO组和任何NC组之间存在显著差异(^#P<0.001），CO组和CO+AG/UnAG组之间（*P=0.044，P=0.012；分别），采用单因素方差分析，然后进行Tukey检验。**（C）**MyoD的量化标准化为GAPDH。CO组和任何NC组之间存在显著差异(^#P=0.008，P=0.008；分别为P=0.039），采用单因素方差分析，然后进行Dunnett的T3测试。**（D）**C2C12肌管中肌生成素mRNA的水平。mRNA水平根据GAPDH标准化。NC组和CO组之间存在显著差异(^#P<0.001），CO组和CO+AG组之间（*P=0.039），采用单因素方差分析，然后进行Tukey检验。**（E）**C2C12肌管中MyoD mRNA的水平。mRNA水平根据GAPDH标准化。NC组和CO组之间存在显著差异(^#P＜0.001，P＜0.009；分别为P=0.031），在CO和CO+AG组之间（*P=0.016），通过单因素方差分析和Dunnett T3检验。数据表示为平均值±SD。

**图4。AG/UnAG降低了共培养肌管中的蛋白水解标记物并增加了蛋白合成标记物**
**（A）**蛋白质水平的蛋白质印迹。**（B）**肌生成抑制素的定量按照GAPDH标准化。CO组和任何NC组之间存在显著差异(^#在CO组和CO+AG/UnAG组之间（*P<0.001），采用单因素方差分析，然后进行Tukey检验。**（C）**C2C12肌管中肌抑制素mRNA的水平。mRNA水平根据GAPDH标准化。CO组和任何NC组之间存在显著差异(^#在CO组和CO+AG/UnAG组之间（*P<0.001），采用单因素方差分析，然后进行Tukey检验。**（D）**p-Smad3的定量标准化为总Smad3。通过单因素方差分析和Tukey检验，六组之间未发现显著差异。**（E）**p-Akt的量化标准化为总Akt。CO组和任何NC组之间存在显著差异(^#P<0.001），CO组和CO+AG/UnAG组之间（分别为*P=0.001，P<0.001），采用单因素方差分析，然后进行Tukey检验。**（F）**p-mTOR的量化标准化为总mTOR。CO组和任何NC组之间存在显著差异(^#P<0.001），CO组和CO+AG/UnAG组之间（*P=0.001，P=0.009；分别），采用单因素方差分析，然后进行Tukey检验。**（G）**p-4EBP1的定量标准化为总4EBP1。CO组和任何NC组之间存在显著差异(^#P<0.001），CO组和CO+UnAG组之间（*P=0.025），采用单因素方差分析，然后进行Tukey检验。**（H）**p-FoxO3a的定量按照GAPDH标准化。CO组和任何NC组之间存在显著差异(^#CO组和CO+AG组之间（*P=0.014），采用单因素方差分析，然后进行Tukey检验。**（一）**FoxO3a的定量标准化为Lamin A。CO组和任何NC组之间存在显著差异(^#CO组和CO+AG/UnAG组之间（分别为*P=0.033，P=0.005），采用单因素方差分析，然后进行Tukey检验。**（J）**IκB的定量按照GAPDH标准化。CO组和任何NC组之间存在显著差异(^#P=0.015，P=0.002，P=0.017），采用单因素方差分析，然后进行Tukey检验。**（K）**NF-κB的定量标准化为拉明A。CO组和任何NC组之间存在显著差异(^#P＜0.001），在CO和CO+AG/UnAG组之间（*P＜0.001），通过单因素方差分析和Tukey检验。数据表示为平均值±SD。

**图5。AG/UnAG抑制共培养肌管中泛素E3连接酶的表达**
**（A）**C2C12肌管中atrogin-1、MuRF1和GAPDH的蛋白质印迹。**（B）**将atrogin-1的定量标准化为GAPDH。CO组和任何NC组之间存在显著差异(^#P<0.001），CO组和CO+AG/UnAG组之间（分别为*P=0.001，P<0.001），采用单因素方差分析，然后进行Tukey检验。**（C）**MuRF1的量化标准化为GAPDH。CO组和任何NC组之间存在显著差异(^#P=0.002），在CO组和CO+AG/UnAG组之间（*P=0.015，P=0.037；分别），通过单向方差分析，然后进行Tukey检验。**（D）**C2C12肌管中阿特拉津-1 mRNA的水平。mRNA水平根据GAPDH标准化。NC组和CO组之间存在显著差异(^#P=0.024），在CO组和CO+AG/UnAG组之间（分别为*P=0.034，P=0.033），通过单因素方差分析，然后进行Dunnett的T3测试。**（E）**C2C12肌管中MuRF1 mRNA的水平。mRNA水平根据GAPDH标准化。NC组和CO组之间存在显著差异(^#P=0.006，P=0.006；分别为P=0.007），CO组和CO+AG组之间（*P=0.016，P=0.012），采用单向方差分析，然后进行Tukey检验。数据表示为平均值±SD。

**图6。AG/UnAG减弱共培养肌管中钙蛋白酶系统的活性**
**（A）**C2C12肌管中μ-calpain、m-calpain、calpain-3、calpastatin和GAPDH的Western blot。**（B）**μ-钙蛋白酶的定量按照GAPDH标准化。CO组和任何NC组之间存在显著差异(^#在CO组和CO+AG/UnAG组之间（*P<0.001），采用单因素方差分析，然后进行Tukey检验。**（中-英）**m-calpain、calpain-3和calpastatin的定量按照GAPDH标准化。通过单因素方差分析和Tukey检验，六组之间未发现显著差异。**（F）**C2C12肌管中μ-钙蛋白酶mRNA的水平。mRNA水平根据GAPDH标准化。NC组和CO组之间存在显著差异(^#P=0.005，P=0.007；分别为P=0.007），CO组和CO+AG组之间（*P=0.01，P=0.015），采用单向方差分析，然后进行Tukey检验。数据表示为平均值±SD。

**图7。AG/UnAG减弱共培养肌管中的自噬活性**
**（A）**C2C12肌管中LC3B-II/I、Beclin-1、ATG5和GAPDH的Western blot。**（B-C）**LC3B-II/I比率的量化。在未给予巴非霉素A1的肌管中，CO组和任何NC组之间检测到显著差异(^#P＜0.001），在CO和CO+AG/UnAG组之间（*P＜0.001），通过单因素方差分析和Tukey检验。通过单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett的T3检验，与服用和不服用巴非霉素A1的肌管相比，12个组之间没有显著差异。**（D）**Beclin-1的定量按照GAPDH标准化。CO组和任何NC组之间存在显著差异(^#P<0.001），CO组和CO+UnAG组之间（*P=0.015），采用单因素方差分析，然后进行Tukey检验。**（E）**ATG5的定量标准化为GAPDH。通过单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett的T3检验，六组之间未发现显著差异。**（F）**C2C12肌管中ATG5 mRNA的水平。mRNA水平根据GAPDH标准化。CO组和任何NC组之间存在显著差异(^#在CO组和CO+AG/UnAG组之间（*P<0.001），采用单因素方差分析，然后进行Tukey检验。数据表示为平均值±SD。

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