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.2017年10月20:6:e31926。
doi:10.7554/寿命31926。

Daam2驱动的VHL降解促进胶质瘤生成

朱文一 1 2, 萨里莎·克里希纳 1, 克里斯蒂娜·加西亚 1, Chia-Ching林俊杰 1, 巴特利·米切尔 三, 肯尼思·斯科特 4, 卡莉·莫希拉（Carrie A Mohila） 5, 查德·克雷顿 6 7, Seung-Hee-Yoo先生 8, 李显炯 9 10 11, 本杰明·德宁 1 2 10 11
附属公司

Daam2驱动的VHL降解促进胶质瘤生成

朱文一等。 埃利夫. .

摘要

Von Hippel-Landau（VHL）蛋白是一种有效的肿瘤抑制因子，可调节多种致癌途径，但VHL突变仅限于有限的恶性肿瘤亚群。在这里，我们确定了一种新的机制来抑制没有失活突变的肿瘤中的VHL。利用发育过程来揭示导致肿瘤发生的新途径，我们发现Daam2促进胶质瘤的形成。蛋白表达筛查发现Daam2和VHL在包括胶质瘤在内的许多癌症中的表达呈负相关。这些在硅片中的见解指导了确凿的功能研究，研究表明Daam2通过抑制VHL表达促进肿瘤发生。此外，生化分析表明，Daam2与VHL相关，并促进其泛素化和降解。总之，这些研究首次定义了癌症中调控VHL抑制的上游机制，并描述了Daam2在肿瘤发生中的作用。

关键词：癌症生物学；人类；小鼠；肿瘤生物学；人类。

PubMed免责声明

利益冲突声明

没有宣布竞争利益。

数字

图1。
图1.Daam2在人脑胶质瘤中表达。
(A类)癌症谱中Daam2 RNA表达的分析。数据由TCGA研究网络生成，可公开获取（见方法）。方框图表示5%、25%、50%、75%和95%。星号表示与相应的非肿瘤组（“正常”）相比，肿瘤组显著升高（红色）或降低（蓝色）。通过对数转换数据的t检验生成P值。(B类)人脑胶质瘤组织芯片中Daam2表达原位杂交分析的病理分级示例。请注意，分数为0表示没有表达式，而分数为3表示表达式非常高。(C类)B组样本中Daam2表达的分级病理评分（0-低强度，3-高强度）；值是来自组织微阵列的LGG和GBM肿瘤的百分比，其被分配相应的分数。(D类)Daam2-LacZ在Daam2小鼠胶质瘤中表达的免疫组织化学分析LacZ公司/+老鼠。
图1——图补充1。
图1-图补充1.Daam2在人类神经胶质瘤实验模型中表达。
(A类)组织微阵列显示人类DAAM2在35个LGG（红框）和40个GBM（绿框）中的原位杂交表达分析。蓝色方框表示正常人脑样本。(B类)原发性人脑胶质瘤样本及相关非肿瘤白质中DAAM2的qRT-PCR分析。(C–H型)DAAM2在GBM1和GBM2细胞系产生的异种移植瘤中的表达。(D–E、G–H)使用反义探针进行原位杂交的高倍图像显示Daam2 mRNA在这些肿瘤中的表达。(C、 F类)GBM1和GBM2细胞系异种移植瘤的低倍图像显示Daam2在这些肿瘤中广泛表达。E中的比例尺为50 nm，适用于D-E、G-H。
图2。
图2 Daam2加速胶质瘤的发生。
(A–B)感染含有Daam2或GFP对照的慢病毒的人GBM1和GBM2细胞系的细胞增殖分析。(C–D类)用感染Daam2慢病毒的GBM1细胞系或GFP对照进行软琼脂试验，图像具有代表性。每项体外实验均一式三份，重复三次；量化单位为E，**p=0.036。(F类)具有代表性的免疫印迹显示GBM-1细胞系中标记Daam2的异位表达。(G–I型)在7周龄时对患有CRISPR-IUE胶质瘤且Daam2过度表达或控制的小鼠进行代表性生物发光成像。I的成像定量来自7只Daam2过度表达小鼠和8只对照小鼠*p=0.0079。(J–L型)各实验条件下CRISPR-IUE胶质瘤小鼠BrdU表达的免疫组织化学分析。BrdU表达细胞的相对数量以L为单位进行量化，并从每种实验条件下的六只小鼠（每只小鼠四片）中得出***p=0.0019。J中的比例尺为50 nm。E、I和L中的误差线为±SEM。
图2——图补充1。
图2-图补充1.小鼠胶质瘤模型系统。
(A类)图示了这些模型系统中用于引入癌基因或Cas9/guideRNAs进行CRISPR基因编辑的子宫内电穿孔操作的示意图。(B类)说明PB-Ras和CRISPR-IUE模型中胚胎电穿孔操作和胶质瘤发病的时间表。(C类)两种模型中用于生成神经胶质瘤的构建体。(D–F型)第14页PB-Ras模型的代表性图像；D为全脑图像，E为横截面，F为组织病理学分析的H&E染色。(G–I型)CRISPR-IUE模型在P70的代表图像；G为全脑图像，H为横截面，I为组织病理学分析的H&E染色。(J型)CRISPR-IUE模型的Kaplan-Meier生存曲线。(K–P（K–P）)使用ISH显示大脑皮层半球Daam2表达的脑横截面(五十、 O（运行）)和IHC(M、 对)在我们的Ras(K–M公司)和CRISPR(N–P型)胶质瘤小鼠模型。虚线表示皮质中线，带有肿瘤的皮质一侧用K和N中的红色箭头表示(问-答)IHC显示Daam2-LacZ在P14和成年小鼠（8周）皮层GFAP表达的星形胶质细胞中表达。箭头表示GFAP和LacZ的共同表达。
图2——图补充2。
图2-图补充2。Daam2加速PB-Ras模型中胶质瘤的发生。
(A–B)出生后10天，对携带Daam2过度表达或控制的PB-Ras胶质瘤小鼠进行代表性生物发光成像。E的成像定量来自17只Daam2过度表达小鼠和20只对照小鼠*p=0.0019。(C–D类)每种实验条件下PB-Ras胶质瘤小鼠BrdU表达的免疫组织化学分析。BrdU表达细胞的相对数量以F为单位进行量化，并从每种实验条件下的六只小鼠（每只小鼠四片）中得出***p<0.0001。C中的比例尺为50 nm。E-F中的误差线为±SEM。
图3。
图3 Daam2的缺失抑制了胶质瘤的发生。
(A类)qRT-PCR证明在感染含有Daam2-shRNAi慢病毒或干扰对照的人GBM1细胞系中有效下调人Daam2 mRNA表达。(B类)感染人Daam2-shRNAi或干扰控制慢病毒的人GBM1细胞系的细胞增殖分析。(C–E类)移植有转染Daam2-shRNAi或干扰对照的GBM1细胞系的小鼠的代表性生物发光成像，移植后6周成像。图像定量来自7只移植了GBM1/Daam2-shRNAi和5只GBM1/加扰对照的小鼠*p=0.0325。(F–H（飞行高度）)年产生的携带CRISPR-IUE神经胶质瘤的小鼠的代表性生物发光成像Daam2±或达姆2-/-小鼠，8周龄时成像。成像定量来自8达姆2-/-和9Daam2±小鼠**p=0.0049。(I–K型)来自每种实验条件的携带CRISPR-IUE神经胶质瘤的小鼠的BrdU表达的免疫组织化学分析。BrdU表达细胞的相对数量以K为单位进行量化，并从每种实验条件下的六只小鼠（每只小鼠四片）中得出****p=0.00001。I中的比例尺为50 nm。E、H和K中的误差线为±SEM。
图3——图补充1。
图3补充图1.GBM细胞系中Daam2-shRNAi生长缺陷的修复。
(A类)通过小鼠Daam2的过度表达拯救Daam2-shRNAi敲低细胞系中的生长缺陷。在这两种情况下，小鼠Daam2在Daam2-shRNAi（蓝线）存在下的过度表达挽救了Daam2-sh RNAi单独存在的生长缺陷（红线）。(B类)免疫印迹显示在表达Daam2-shRNAi的GBM1/2细胞系中标记Daam2的异位表达。
图4。
图4.Daam2抑制VHL表达。
(A类)RPPA数据的热图分析显示，在PB-Ras小鼠胶质瘤模型中，Daam2过度表达下调了核心组蛋白。(B类)Daam2 mRNA表达与VHL和Akt pS473蛋白表达数据以及HIF1αmRNA表达的相关性。样本中的蛋白质和mRNA表达数据来自癌症蛋白质组图谱（TCPA），与Daam2 mRNA的相关性使用Pearson’s进行。缩略的癌症类型列在顶部面板上，括号中列出了TCPA数据集中针对每种癌症类型分析的肿瘤数量；GBM用绿色文本表示。癌症类型缩写：BLCA：膀胱尿路上皮癌，COAD：结肠腺癌，HNSC：头颈部鳞癌，READ：直肠癌，LUSC：肺鳞癌，UCEC：子宫体子宫内膜癌，BRCA：乳腺癌，LUAD：肺腺癌，OV：卵巢浆液性癌，KIRC：肾肾透明细胞癌，GBM：多形性胶质母细胞瘤。(C–F类)Daam2过度表达的CRISPR-IUE胶质瘤中VHL表达的代表性免疫组化分析(D类)或者击倒Daam2(F类)和相关控件。(G–J型)Daam2过度表达的CRISPR-IUE胶质瘤中Akt pS473表达的代表性免疫组化分析(H（H）)或者击倒Daam2(J型)以及相关的控制。图像代表了对每种实验条件下的六个独立肿瘤进行的分析。(K（K）)利用来自CRISPR-IUE胶质瘤过度表达Daam2或对照的蛋白裂解产物的HIF1α、谷氨酸1和VEGFA抗体进行免疫印迹。C和G中的比例尺为50 nm。
图4——图补充1。
图4补充了1。Daam2对胶质瘤Wnt信号传导的影响和RPPA分析。
(A类)GBM1细胞系中使用Wnt报告子（TOP-Flash）进行荧光素酶报告子分析。细胞系转染Daam2、GFP对照、含和不含Wnt3a以及TOP-FLASH报告基因以测量Wnt活性。注意Daam2本身并不能激活Wnt报告程序；Daam2的激活需要经典Wnt配体Wnt3a的存在。Daam2在Wnt3a环境中的激活非常轻微，约为1.8倍。每项实验一式三份，每组三份。(B类)FACS分析PB-Ras模型中TOP-FLASH-BFP表达细胞的相对数量。我们使用PB-Ras模型进行IUE，包括Daam2过度表达（GOF）和TOP-FLASH-BFP构建。此外，我们在我们的Daam2±和达姆2-/-同样用TOP-FLASH-BFP报告子电穿孔的小鼠（LOF）。在出生后第12天，采集、分离肿瘤并进行FACS分析，我们评估了肿瘤内BFP+/GFP+细胞的相对数量，作为GOF和LOF研究中各自实验条件下Wnt活性的指标。(C–D类)β-catenin抗体对PB-Ras、Daam2-GOF肿瘤的代表性免疫组织化学染色。对每种情况下的六种不同肿瘤进行分析，每个肿瘤四张幻灯片。(E类)Daam2-GOF作用下P7和P14 PB-Ras胶质瘤RPPA蛋白表达分析的中位中心无监督分层聚类热图表示。有关原始数据，请参阅补充文件1，有关其他详细信息，请参阅方法部分。请注意，括号表示Daam2存在时下调的一组核心蛋白质。这些蛋白质如图4a所示。
图4——图补充2。
图4补充图2。Daam2与胶质瘤抑制蛋白之间的相关性。
在PB-Ras Daam2-GOF RPPA分析中Daam2 mRNA表达与下调的核心蛋白组的相关性。另请参见图4a和图4-图补充1，面板E。跨越广泛的癌症。这一广谱癌症的蛋白质和mRNA表达数据来自于从癌症蛋白质组图谱（TCPA）获得的样本，并使用Pearson’s进行了与Daam2 mRNA的相关性研究。缩略的癌症类型列在顶部面板上，括号中列出了TCPA数据集中针对每种癌症类型分析的肿瘤数量。VHL以红色框突出显示。(B–G类)免疫染色显示Daam2-LacZ和VHL在Daam2成人皮层中的表达LacZ公司/+和Daam2LacZ/LacZ公司老鼠。注意，与Daam2-LacZ共同表达的VHL水平在Daam2中增加LacZ/LacZ公司小鼠与Daam2的比较LacZ公司/+小鼠（C v(F类).
图4——补充图3。
图4补充图3。操纵Daam2表达影响血管生成。
在我们的胶质瘤模型中，通过一系列实验操作对血管标记物CD31进行代表性免疫组织化学染色。(A–B)Daam2 GOF背景下的CRISPR-IUE胶质瘤及其相关控制(C–D类)CRISPR-IUE胶质瘤生成于Daam2±和达姆2-/-老鼠；E-F中的定量。E中，*p=0.033。在F中，p=0.0026。(G–J型)VHL-GOF、Daam2-GOF、Daam2+VHL背景下的PB-Ras胶质瘤和对照。对每种情况下的六种不同肿瘤进行分析，每个肿瘤四张幻灯片。量化单位为K:*p=0.034、**p=0.044和***p=0.023。在E、F和K中，误差线为±SEM。
图5。
图5 Daam2通过抑制VHL促进胶质生成。
(A–B)感染含有GFP对照、Daam2、VHL或Daam2+VHL的慢病毒的人GBM1和GBM2细胞系的细胞增殖分析。相关免疫印迹位于C(D–G，U)出生后10天，对携带Daam2过度表达、VHL过度表达、Daam2+VHL过表达或对照的PB-Ras胶质瘤小鼠进行代表性生物发光成像。U的成像定量来自10只Daam2-过表达、9只VHL过表达、6只Daam2+VHL和12只对照小鼠*p=0.0001，**p=0.0046，***p=0.0016(H–K、V)每种实验条件下PB-Ras胶质瘤小鼠BrdU表达的免疫组织化学分析。BrdU表达细胞的相对数量以V为单位进行量化，并从每种实验条件下的六只小鼠（每只小鼠四片）中得出*p=0.0006，**p=0.0009，***p<0.0001。(L–O型)来自所描述的实验条件和相关对照的PB-Ras神经胶质瘤中VHL表达的代表性免疫组织化学分析。(P–S公司)对来自所述实验条件和相关对照的PB-Ras胶质瘤中Akt pS473表达的代表性免疫组织化学分析。(T型)代表性免疫印迹显示Daam2和VHL在各种实验条件下过度表达。L-O中的图像代表了对每种实验条件下的六个独立肿瘤进行的分析。通过单因素方差分析（ANOVA）得出的统计数据，然后进行组间比较的Tukey检验。F中的比例尺为50 nm。U和V中的误差线为±SEM。
图6。
图6.Daam2介导VHL降解和泛素化。
(A类)Flag-Daam2的免疫沉淀，然后用VHL对来自过度表达Flag-Daam2的PB-Ras胶质瘤的裂解物进行免疫印迹。检测“IP”通道中的内源性VHL表明Daam2与小鼠胶质瘤中的VHL相关。使用HA-VHL下拉Flag-Daam2进行反向IP。(B、 D类)用VHL和Daam2（或对照）转染293个细胞。转染24小时后，用40μg/ml环己酰亚胺（蛋白酶体抑制剂）处理细胞，并在收获前培养指定时间。使用抗VHL抗体进行Western blotting监测VHL水平。D中的量化显示了Daam2对VHL稳定性的影响。在Daam2存在的情况下，VHL的半衰期（5.082小时）显著降低（3.679小时）。误差线代表平均值±SEM（n=3）。半衰期是通过非线性单相指数衰减分析确定的（半衰期参数K在两种条件下显著不同：p=0.0081）。误差线代表平均值±SEM（n=3）。(C类)Daam2增强VHL泛素化。293个T细胞联合转染Flag-VHL、HA-UB（泛素）和Myc-Daam2。细胞在收获前6小时用MG132（10 ug/ml）处理。用抗Flag M2珠免疫沉淀全细胞裂解物，然后用Flag和HA抗体进行western印迹分析。
作者回复图片1。
作者反应图1.过表达Daam2的CRISPR-IUE肿瘤的Caspase3染色。
作者回复图片2。
作者反应图片2.CRISPR-IUE肿瘤模型，结合CRISPR删除VHL，在Daam2+/-或Daam2-/-背景中生成。
在这个模型中，VHL的缺失加速了胶质瘤的形成。(A类)Kaplan-Meyer生存曲线。（C-D）P8。
作者回复图片3。
作者回复图片3.Daam2截短突变体的Co-IP（见Lee等人，2012）和VHL。
这些数据表明，每个Daam2截断突变体都能与Daam2结合。
作者回复图片4。
作者反应图4..qRT-PCR显示Daam2在6个原代GBM细胞系中的相对表达。
作者回复图片5。
作者反应图5.高水平的VHL不会相互降解Daam2。
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