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.2017年10月19日。
doi:10.1038/s41551-017-0069。 Epub 2017年5月10日。

成熟诱导的多潜能干细胞衍生的人足细胞在芯片上重建肾小球小球功能

萨米拉·穆萨 1 2 3, 阿基科·曼莫托 4, 托马斯·费兰特 1, Sauveur S F Jeanty公司 1, 马里科·平野·小林 1 4, 塔达诺里·曼莫托 4, 克里斯汀·罗伯茨 1, Seyoon Chung先生 1, 理查德·诺瓦克 1, 迈尔斯·英格拉姆 1, 托希德·法塔纳德·迪达尔 1, Sandeep Koshy公司 1, 詹姆斯·C·韦弗 1, 乔治·M·丘奇 1 2 3, 唐纳德·英格勃 1 3 4 5
附属公司

成熟诱导的多潜能干细胞衍生的人足细胞在芯片上重建肾小球小球功能

萨米拉·穆萨等。 国家生物工程. 2017.

摘要

安在体外人肾小球是血液滤过的主要部位，其模型可以促进药物的发现并阐明肾脏疾病的机制。微流控芯片上器官技术已被用于模拟人类近端小管，但由于缺乏功能性人类足细胞（调节肾小球选择性通透性的细胞），芯片上肾小球尚不可能。在这里，我们证明了一种有效的（>90%）和化学定义的方法，用于将人类诱导的多能干细胞（hiPS）分化为足细胞，足细胞表达成熟表型标记（nephrin+、WT1+、podocin+、Pax2-），并表现出初级和次级足突。我们还发现，当hiPS细胞衍生的足细胞与人肾小球内皮细胞在一个有机芯片微流控设备中共同培养时，hiPS细胞产生肾小球基底膜胶原，并重新组合肾小球的自然组织/组织界面，以及白蛋白和菊糖的不同清除率。芯片上肾小球还模拟了阿霉素诱导的蛋白尿和足细胞损伤。这个在体外用成熟人足细胞建立人肾小球功能模型可能有助于药物开发和个性化药物应用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争性财务利益D.E.I.和S.M.是一项正在申请专利的作者，该专利涉及从多能干细胞生成肾小球足细胞的方法（美国专利申请14/950859）。D.E.I.是Emulate，Inc.的创始人和股东，并担任其科学咨询委员会主席。

数字

图1
图1。肾足细胞与人iPS细胞的高效分化
(A类)hiPS细胞定向分化为足细胞时间表的示意图。BMP7，骨形态发生蛋白7；血管内皮生长因子；RA，维甲酸；L511，层粘连蛋白511；L511-E8，层粘连蛋白511E8片段；L21，层粘连蛋白521。(B)分化各阶段细胞的低（顶部）和高（底部）放大亮场图像（顶部和底部分别为100和50μm的条形图）。(C类)Bight-field图像和(D类)游离（非粘附）hiPS细胞、hiPS衍生足细胞和永生化人类足细胞直径（y轴）散点图。棒，50μm；误差条表示平均值的标准偏差，n个=20个单元；n.s.，不重要；***，第页<0.0001. (E类)流式细胞术分析hiPS细胞、hiPS衍生足细胞和永生化人足细胞中多能性和足细胞标记的表达。显示Oct4多能性标记、Wilm’s tumor 1（WT1）肾细胞标记、nephrin足细胞特异性标记以及WT1和nephrin-双重表达水平的代表性图(F类)流式细胞术分析的定量表示。Y轴表示Oct4（米色）、WT1（紫色）、nephrin（绿色）阳性细胞以及WT1和nephrin（红色）双重阳性细胞的百分比。误差线表示平均值的标准偏差，n个=3个独立实验。
图2
图2。人iPS-衍生足细胞表达成熟表型的标志物
(A类)免疫染色Pax2、WT1和nephrin的中间中胚层、hiPS衍生足细胞和人类永生足细胞的代表性荧光显微图像(B)hiPS衍生足细胞的量化表明足细胞标记物（nephrin、WT1和podocin）上调，多能性标记物Oct4相应降低。祖细胞标记物Pax2和OSR1的减少，以及hiPS衍生足细胞中缺乏EdU掺入，表明这些细胞与成熟足细胞一样是有丝分裂后的终末分化细胞。误差线表示平均值的标准偏差，n个= 3; 高功率场；OSR1，奇跳相关转录因子蛋白1；乙二胺四乙酸，5-乙炔基-2′-脱氧尿苷。(C类)免疫染色的hiPS衍生足细胞和永生人足细胞的免疫荧光显微图像，以检测PKCλ/I，推测的肾素向细胞表面的转运。(D类)hiPS细胞、hiPS衍生足细胞和人类永生化足细胞中总蛋白和磷酸化PKCλ/I蛋白水平的Western blot分析。(E类)蛋白质印迹定量磷酸化PKCλ/I水平。误差线表示平均值的标准偏差，n个= 3; *,第页<0.05; **,第页<0.001; ***, p<0.0001；棒材，100μm。
图3
图3。人iPS-衍生足细胞表现出初级和次级细胞过程，并增强了外源性白蛋白的分子摄取
(A类)顶部面板，hiPS衍生足细胞和人类永生足细胞的荧光显微图像，对足细胞进行了足细胞素免疫染色（绿色）。底部面板，hiPS衍生足细胞和人类永生足细胞的扫描电子显微镜图像。(B)对hiPS衍生足细胞和人类永生足细胞进行FcRn（品红色）免疫染色，这是白蛋白和IgG运输的受体。(C类)暴露于外源性白蛋白（绿色）的hiPS细胞、hiPS衍生足细胞和人类永生化足细胞（Imm.足细胞）的共焦显微图像。白色箭头表示细胞吸收白蛋白。(D类)根据所示数据对蛋白阳性细胞进行量化C类误差条表示平均值的标准偏差，n个= 3; ***,第页< 0.0001; hpf，高功率场。比例尺：(A类)50μm（顶面板），10μm（底面板）(B)100微米(C类)50微米。
图4
图4。用有机芯片微流体装置模拟人肾小球毛细血管壁
(A类)肾小球毛细血管壁示意图，足细胞和内皮细胞由肾小球基底膜（GBM）分隔。分子从毛细血管腔流向泌尿腔的方向流动示例如箭头所示。(B)微流控芯片器件的照片（左）和示意图（右），该器件具有复制肾小球泌尿和毛细血管室的微通道。肾小球基底膜是使用一种多孔的柔性PDMS膜复制的，该膜具有ECM蛋白层粘连蛋白的功能。通过真空拉伸柔性PDMS膜，向细胞层施加循环机械应变。(C类)hiPS衍生足细胞（左）在芯片上的器官微设备中分化，原代人肾小球内皮细胞（右）在柔性膜的对面培养的明亮视野显微图像。(D类)hiPS衍生足细胞在有机芯片微流控设备中与PDMS膜对面培养的人肾小球内皮细胞（未显示）分化的荧光显微图像。细胞仅在流体流动（无应变）或流体流动和10%机械应变（10%应变）下分化。对细胞进行nephrin免疫染色（绿色），并用DAPI（蓝色）进行复染。(E类)hiPS衍生足细胞中胞质与核nephrin比率的图示，这些足细胞在芯片上通过或不通过机械应变进行分化。误差条表示平均值的标准偏差，n个= 3. (F类)hiPS衍生足细胞（顶层，绿色）和人类肾小球内皮细胞（底层，洋红色）形成的组织-组织界面的三维重建视图结果表明，周期性应用10%菌株可增强足细胞突起通过柔性ECM涂层PDMS膜的孔的延伸，从而将其插入肾小球内皮细胞的透明表面。误差线表示平均值的标准偏差，n个= 4. 比例尺，100μm*第页< 0.05.
图5
图5。微流控芯片器件重建肾小球毛细血管功能在体外
(A类)微流控芯片上肾小球中分化的hiPS齿状细胞分泌VEGF-A。(B)白蛋白和菊粉分子在6小时内连续输注到由hiPS衍生的足细胞和人肾小球内皮细胞排列的肾小球芯片的毛细管通道中的肾小球滤过（尿清除率）的定量。将结果与体内根据肾小球毛细血管表面积估计值体内. (C类)使用上述方法对缺乏人肾足细胞的对照微流控芯片中的白蛋白和菊糖进行过滤，并在连续输注6小时后进行定量。(D类)免疫荧光显微镜视图显示在存在或不存在生理循环机械应变的情况下，微流控肾小球芯片中基底膜蛋白IV型胶原（绿色）的产生和分布（下面板显示肾小球芯片的侧面视图；细胞核用DAPI蓝色复染）。(E类)在有或无机械应变的情况下，通过肾小球芯片中的足细胞和内皮层量化IV型胶原的生成，如D。（比例尺，100μm，用于面板A类,B,C类和E类，误差条表示平均值的标准偏差；n个= 4; 不显著*第页< 0.05; **第页< 0.001***第页< 0.0001).
图6
图6。人肾小球芯片模拟阿霉素诱导的肾小球损伤
(A类)肾小球芯片内hiPS衍生足细胞层的相位对比图像，通过肾小球内皮细胞衬衬的血管通道持续注入不同浓度的阿霉素5天。(B)对照和阿霉素处理的肾小球芯片中的足细胞和内皮细胞层的荧光显微镜图像，用鬼笔肽染色（黄色）并用DAPI复染（蓝色）。(C类)药物治疗5天后，使用DAPI染色细胞的荧光显微镜定量法测量阿霉素暴露对肾小球芯片中足细胞和内皮细胞群内细胞粘附的剂量依赖性影响。(D类)量化阿霉素暴露对肾小球芯片中白蛋白和菊糖的肾小球滤过（尿清除）的剂量依赖性影响。(E类)阿霉素诱导损伤后hiPS衍生足细胞层对尿路外源性白蛋白摄取的定量（比例尺，100μm）C类,D类、和E类，误差条代表S.D。，n个= 3; n.s.，不重要*第页< 0.05; **第页< 0.001***第页< 0.0001).
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中的注释

  • 生物工程：芯片肾小球。
    Allison SJ公司。 Allison SJ公司。 Nat Rev Nephrol公司。2017年7月；13(7):382. doi:10.1038/nrneph.2017.79。Epub 2017年6月5日。 Nat Rev Nephrol公司。2017 PMID：28579613 没有可用的摘要。
  • 建立肾小球滤过屏障模型：你对我有兴趣吗？
    Romagnani P，千层面。 Romagnani P等人。 细胞干细胞。2017年7月6日；21(1):7-9. doi:10.1016/j.stem.2017.06.008。 细胞干细胞。2017 PMID：28686869

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