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.2017年10月23日；43（2）：186-197.e7。
doi:10.1016/j.devcel.2017.09.012。 Epub 2017年10月12日。

PLD2-生成的磷酸与KIF5B结合促进小鼠乳腺癌细胞MT1-MMP表面转运和肺转移

王自清 1, 张峰（音） 2, 何景泉 1, 吴平 1, 李伟Rachel Tay 1, 蔡铭（Ming Cai） 三, 围棋年 4, 翁媛媛 5, 李勤 6, Jeffrey T Chang先生 1, 劳拉·B·麦金泰尔 7, 吉尔伯特·迪保罗 7, 徐建明 6, 彭俊敏 8, 杜光伟 9
附属机构

PLD2-生成的磷酸与KIF5B结合促进小鼠乳腺癌细胞MT1-MMP表面转运和肺转移

王自清等。 开发人员单元格. .

摘要

关于促进转移的细胞事件知之甚少。我们发现磷脂酶D的敲除2（PLD2）产生信号脂质磷脂酸（PA），抑制乳腺肿瘤病毒（MMTV）-Neu转基因小鼠乳腺癌模型中的肺转移。PLD2通过调节MT1-MMP及其相关侵袭因子的质膜靶向性促进局部侵袭。脂质体下拉屏幕将运动蛋白驱动蛋白-1的重链KIF5B确定为一种新的PA结合蛋白。体外实验显示PA特异性地直接结合到KIF5B的C末端。PLD2生成的PA和KIF5B之间的结合是KIF5B的囊泡结合、MT1-MMP的表面定位、侵袭性和癌细胞侵袭所必需的。总之，这些结果确定了PLD2生成的PA在调节运动蛋白-1运动功能和乳腺癌转移中的作用，并表明PLD2是转移性乳腺癌的潜在治疗靶点。

关键词：KIF5B；MT1-MMP；PLD；PLD2；乳腺癌；入侵昆虫；转移；磷脂酸；磷脂酶D。

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数字

图1
图1
PLD2促进肺转移MMTV-欧盟乳腺癌小鼠模型。（A） PLD2缺乏不影响肿瘤发生。乳腺肿瘤的外观在年每周检查一次MMTV-Neu；第2层+/+（n=22）和MMTV-Neu；第2层−/−小鼠（n=25）。（B） PLD2缺陷不影响肿瘤大小。在年首次出现可触及的肿瘤后，每周测量肿瘤大小MMTV-Neu；第2层+/+（n=27）和MMTV新；第2层−/−（n=24）只小鼠。（C） 乳腺肿瘤重量MMTV-Neu；第2层+/+（n=24）和MMTV-Neu；第2层−/−（n=21）在首次出现可触及肿瘤后9周收集小鼠。（D） 肺肿瘤的宏观图像MMTV-Neu；第2层+/+小鼠和MMTV-Neu；第2层−/−老鼠。转移用箭头表示。比例尺=1.5 mm。（E）D中宏观肺转移的量化。MMTV-Neu；第2层+/+（n＝26），MMTV-Neu；第2层−/−（n=22）。（F） 代表性H&E染色肺组织切片。转移用箭头表示。比例尺=100μm。（G） 荷瘤小鼠肺部肿瘤病灶的量化。n=每组12人。量化表示为平均值±标准偏差；t检验，**p<0.01，NS（不显著，p>0.05）。另请参见图S1。
图2
图2
PLD2缺乏会减少循环肿瘤细胞的数量和培养的癌细胞的侵袭。（A） PLD2缺乏小鼠循环肿瘤细胞减少。n=19/组。（B） 悬浮培养的原代乳腺癌细胞的存活数量。n=3。（C） 在含有二甲基亚砜或PLD2抑制剂（5μM）的悬浮液中培养的存活MDA-MB-231细胞的数量。n=3。（D） 原发性乳腺癌细胞的侵袭MMTV-Neu；第2层+/+和MMTV新；第2层−/−老鼠。n=3。（E） 原发性乳腺癌细胞的侵袭MMTV-欧盟二甲基亚砜或PLD2抑制剂（5μM）存在的小鼠。n=3。（F） 二甲基亚砜或PLD2抑制剂（5μM）对MDA-MB-231细胞的侵袭。n=3。量化表示为平均值±标准偏差；t检验，***p<0.001。
图3
图3
PLD2缺乏阻断癌细胞中的侵袭因子的形成。（A） PLD2缺乏可减少侵入体的形成体内在小鼠乳腺肿瘤冰冻切片中，通过皮质素和Tks5的共定位（箭头所示）来鉴定侵袭虫。每个基因型n=4。对来自六个不同领域的至少200个细胞进行了分析。（B） 定量分析A（C）PLD2中的侵入体细胞并不调节TKS5和皮质素的表达。（D）第2层敲除基因阻断原发性乳腺癌细胞内侵袭性蛋白的形成在体外通过去除箭头标记的荧光标记明胶（黑点）来鉴定入侵蜱。（E） D.n=3中入侵昆虫的数量。（F） PLD2抑制剂（5μM）阻断MDA-MB-231细胞内隐孢子的形成。（G） 在F.n=3中入侵昆虫的定量。比例尺=10μm。量化表示为平均值±标准偏差；t检验，**p<0.01，***p<0.001。
图4
图4
抑制PLD2导致MT1-MMP质膜定位丢失和细胞内小泡积聚。（A） 利用原发性肿瘤冰冻切片对癌细胞MT1-MMP进行免疫荧光染色。图片是每种基因型的4只小鼠的肿瘤代表。（B） 流式细胞术分析的荧光强度直方图显示MT1-MMP细胞在原发性肿瘤细胞中的表面表达。（C） MT1-MMP荧光强度中值的统计结果。背景IgG荧光被减去。n＝3。（D和E）内源性MT1-MMP（D）或MT1-MMP-GFP（E）在用DMSO或PLD2抑制剂（5μM）处理的MDA-MB-231细胞中的定位。（F） MT1-MMP-GFP在含有DMSO或PLD2抑制剂（5μM）的Alexa 594标记明胶上的MDA-MB-231细胞中的定位。从一系列X-Y共焦图像重建X-Z图像。虚线勾勒出X-Z重建中的细胞板轮廓。（G） PLD2缺乏并不影响肿瘤中MT1-MMP的表达。每个基因型从4只小鼠的肿瘤中采集蛋白质样本。（H） PLD2抑制剂对MDA-MB-231细胞中MT1-MMP的表达无影响。对照组和PLD2抑制剂治疗组重复进行。（一） PLD2调节MT1-MMP在细胞表面的再循环。细胞表面蛋白在冰上标记有（第2-7道）或不标记生物素（第1道）15分钟。生物素化细胞在37°C下孵育30分钟以允许内吞，然后在冰上处理有或没有MESNA（第一道MESNA）以分别测量细胞内（第3道）和总（第2道）标记蛋白。内化后，将生物素化细胞在37°C下培养15分钟（第4和第5道）或30分钟（第6和第7道），以允许再循环，然后用或不用MESNA处理（第二道），分别测量细胞内（第5和第7车道）和总（第4道和第6道）标记蛋白。通过链霉亲和素珠回收生物素化蛋白，并使用MT1-MMP抗体进行蛋白质印迹分析。（J） I中结果的量化。将细胞内标记的MT1-MMP标准化为总标记的MT1-MMP。n=3。比例尺=10μm。量化表示为平均值±标准偏差；t检验，*p<0.05，***p<0.001，NS（p>0.05）。另请参见图S2–S4。
图5
图5
KIF5B直接特异性地与PA结合。（A） PA结合蛋白的筛选策略。（B） 通过脂质体下拉法和质谱法鉴定PA结合蛋白。蛋白质名称旁边括号中的数字表示光谱计数。（C） ●●●●。由两个KIF5B和两个驱动蛋白轻链（KLC）组成的驱动蛋白-1运动蛋白的结构域。KIF5B（KIF5B-C）的C端是货物绑定域。（D） ●●●●。纯化的KIF5B C末端（KIF5B-C）与PA特异性结合，在脂质条带结合试验中与其他磷脂结合程度较低。（E） 纯化的KIF5B-C在脂质体下拉试验中与PA特异结合。使用GST抗体通过Western blot检测与含有指示磷脂的脂质体结合的KIF5B-C。（F） 使用饱和脂质体（1 mM）鉴定KIF5B上的PA结合位点。KIF5B-C上的候选PA结合位点和相应的丙氨酸突变体。KIF5B-C野生型和突变体PA结合能力的低蛋白免疫印迹分析。（G） 使用连续稀释的脂质体鉴定A5作为KIF5B上的关键PA结合位点。突变体A4/A5没有进一步降低KIF5B的PA结合。（H） PA结合的定量结果为G.n=3。量化表示为平均值±标准偏差；t检验，**p<0.01，***p<0.001。另请参见图S5和表S1-S3。
图6
图6
PLD2生成的PA将KIF5B偶联到选定的囊泡，对MT1-MMP质膜定位、侵入体形成和侵袭至关重要。（A） 乳腺肿瘤冷冻切片中PLD2缺陷癌细胞中KIF5B相关囊泡的凝聚。（B） PLD2抑制剂处理降低了MDA-MB-231细胞中KIF5B膜的结合。（C） PLD2抑制剂破坏了KIF5B与MT1-MMP囊泡的联系。（D） 定量KIF5B和MT1-MMP在C.（E）Western blotting中的共定位，显示ARF6的敲除和外源性ARF6野生型和N48R的重新表达。（F） KIF5B与MT1-MMP囊泡的结合不需要ARF6。（G） 在F（H）PLD2中KIF5B和MT1-MMP共同定位的量化与KIF5B相互作用。使用PLD2抗体（#226）在MDA-MB-231细胞中IPD2，并通过免疫印迹法检测KIF5B的相关性。WCL，全细胞裂解物。（I） 用GFP抗体在稳定表达GFP-KIF5B的MDA-MB-231细胞中IPed GFP-KIF5B，并通过免疫印迹检测内源性PLD2的结合。（J） PLD2和KIF5B在MT1-MMP囊泡上的共扩增。表达Flag-PLD2和MT1-MMP-GFP的MDA-MB-231细胞用小鼠KIF5B（SUK 4-c）/Alexa 568山羊抗鼠二级抗体和兔Flag/Alexa647山羊抗兔二级抗体染色。（K） PA结合的破坏阻断了MDA-MB-231细胞中KIF5B的膜结合。（五十） Western blot显示内源性KIF5B被敲除，外源性KIF5 B和KIF5B-PA重新表达−MDA-MB-231细胞中的突变。（M-O）野生型KIF5B，但不是KIF5B-PA−突变体挽救了表达KIF5B shRNA的MDA-MB-231细胞中MT1-MMP质膜定位（M）、侵入体形成（N）和侵入（O）的细胞缺陷。N=3。用共焦显微镜拍摄A、B、K和M的照片（比例尺=10μM）。C、F和J中的图片由N-SIM超分辨率显微镜拍摄（比例尺=1μm）。量化表示为平均值±标准偏差；t检验，**p<0.01，***p<0.001，NS（p>0.05）。另请参见图S6。
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中的注释

  • PLD和PA服用MT1-MMP进行转移治疗。
    Thapa N，Anderson RA。 Thapa N等人。 开发单元。2017年10月23日；43(2):117-119. doi:10.1016/j.devcel.2017.10.12。 开发单元。2017 PMID：29065302 免费PMC文章。

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