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.2017年11月2日；171（4）：918-933.e20。
doi:10.1016/j.cell.2017.09.040。 Epub 2017年10月12日。

异型泛素链在细胞周期和蛋白质质量控制中的组装和功能

理查德·G·尤 1, 科尔斯汀·多纳 2, 埃里克·卡斯特拉诺斯 三, 戴安·哈肯森 1, 阿奇姆·沃纳 2, 王楠（Nan Wang） 4, X威廉·杨 4, 纳迪娅·马丁内斯·马汀 5, Marissa L Matsumoto女士 6, Vishva M Dixit公司 7, 迈克尔·雷普 8
附属公司

异型泛素链在细胞周期和蛋白质质量控制中的组装和功能

理查德·G·尤等。 单元格. .

摘要

泛素链翻译后修饰控制所有真核生物的细胞命运。根据亚单位之间的连接，不同的泛素链类型触发不同的输出，如分别驱动蛋白质降解或复杂组装的K48和K63连接的结合物所示。最近的生化分析也表明了混合或分支泛素链的作用，但由于没有监测内源性结合物的方法，人们对异型聚合物的生理意义仍知之甚少。在此，我们设计了一种双特异性抗体来检测K11/K48连锁链，并将有丝分裂调节因子、错误折叠的新生多肽和病理性亨廷顿蛋白变体作为其内源性底物。我们表明，K11/K48链是由在神经退行性疾病中突变的必要泛素连接酶和效应器合成和处理的；因此，这些结合物可以促进聚集蛋白的蛋白酶体快速清除。通过揭示K11/K48链在细胞周期和质量控制中的关键作用，我们建立了异型泛素结合物作为生物信息的重要载体。

关键词：亨廷廷；亨廷顿病；后指复合体；分支泛素链；蛋白酶体；蛋白质质量控制；泛素；泛素链。

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数字

图1
图1。一种双特异性抗体特异性检测K11/K48连接的异型泛素链
答：。本研究中产生的双特异性抗体以及已建立的K11和K48单特异性抗体概述（Matsumoto等人，2010；Newton等人，2008）。B。K11/K48异种抗体纯化的最终尺寸排除色谱法。C、。K11/K48-双特异性抗体检测K11/K48支链泛素三聚体。使用所示抗体通过考马斯凝胶电泳或Western blots分析等水平的单体泛素、所有可能的泛素二聚体和K11/K48支链泛素三聚体。D。K11/K48异特异性抗体检测K11/K48-，但不检测K11/K63-或K48/K63-分支。在相同抗体浓度和暴露时间下，使用所示抗体通过Western blotting分析等浓度的分支泛素三聚体。E.公司。K11/K48-双特异性抗体检测K11/K48-，但不检测M1/K63支链泛素。如上所述分析重组泛素三聚体。F、。K11/K48双特异性抗体可以区分高分子量泛素链。使用E3 APC/C、E2酶UBE2S和/或UBE2G2的工程泛素连接系统（Meyer和Rape，2014）CTP公司和泛素被用于生成K11/K48支链和同型K11或K48链。分别使用K11/K48双特异性抗体或识别K11或K48链的已建立的单特异性抗体分析链形成。在相同的抗体浓度和暴露时间下分析Western blot（即解释对照抗体缺乏信号）。G.公司。K11/K48异种抗体允许通过免疫沉淀纯化K11/K48-支链。K11/K48支链泛素链组装在35使用相同浓度的K11/K48-、K11/gD-或K48/gD-抗体对S标记的APC/C底物细胞周期蛋白A（Meyer和Rape，2014）和结合物进行亲和纯化。放射自显影后对纯化的放射性进行定量；量化显示了三个独立的实验；（n=3；扫描电镜）。
图2
图2。APC/C组装异型K11/K48链
答：。APC/C产生K11/K48连接的泛素链在体外从人类有丝分裂细胞纯化的APC/C与起始E2 UBE2C浓度增加、分支E2 UBE_2S水平恒定和底物细胞周期蛋白A孵育。使用所示抗体通过Western blotting评估细胞周期蛋白A的泛素化。B。K11/K48连锁链在有丝分裂期间积累。HeLa细胞在中期同步，释放到细胞分裂中，并在指定的时间点进行蛋白质表达分析。用对照siRNAs转染细胞或以UBE2S为靶点的经验证siRNA转染细胞（Kelly等人，2014）。C、。CDC20和细胞周期蛋白A在细胞中被K11/K48支链修饰。以上：Lys490泛素化的CDC20肽仅在K11/K48异种中检测到，而在K11/gD-或K48/gD-对照亲和纯化中未检测到。CDC20上未检测到其他泛素化位点。下部面板：在变性条件下用指示的抗体从有丝分裂裂解物中亲和纯化泛素链。通过特异性抗体检测共纯化内源性CDC20或细胞周期蛋白A。星号标记了一个非特异性条带，该条带是由洗脱过程中偶然的抗体解离引起的。D。内源性NEK2A和细胞周期蛋白A可能被K11/K48连接的泛素链修饰。从存在或不存在蛋白酶体抑制剂的有丝分裂HeLa细胞中亲和纯化不同拓扑的泛素结合物，并使用特定抗体通过Western blotting进行分析。K48特异性抗体无法纯化NEK2A可能是由埋藏在分支泛素结合物中的少量K48链引起的（Meyer和Rape，2014）。内源性细胞周期蛋白A被K11/K48连接的泛素链修饰，或被含有K48-的不同共轭物修饰，但K11连接较少。
图3
图3。细胞通过组装K11/K48支链对蛋白毒性应激反应
答：。用蛋白酶体（红色）、HSP70-（黄色）、HSP40-抑制剂（蓝色）或其他应激源处理293T细胞，并使用特定抗体通过Western blotting监测具有指定拓扑结构的泛素链的形成。B。错误折叠蛋白的积累导致K11/K48支链的形成。表达泛素的293T细胞TEV/标志如图所示，在MG132的存在下生长。使用K11/K48异种抗体亲和纯化K11/K48-连锁链，并进行TEV裂解。作为每个附加的泛素TEV/标志留下~2kD的“印记”，具有两个或更多印记的分支泛素分子可以通过αFLAG Western blotting检测到（Meyer和Rape，2014）。仅显示了αFLAG Western blot的相关MW区域。C、。聚集的新合成蛋白质被K11/K48链强烈标记。用DMSO或HSP70抑制剂pifithrinµ处理细胞，然后使用荧光标记的K11/K48异特异性抗体（黄色）对K11/K48-连锁链进行染色。DNA用Hoechst（蓝色）染色。抑制mRNA翻译（环己酰亚胺、依米汀、三尖杉酯碱），但不抑制转录（α-amanitine），阻止K11/K48阳性聚集物的形成。D。经历蛋白质毒性应激的细胞中K11/K48链的产生依赖于新的蛋白质合成。如上所述，用HSP70抑制剂pifithrinµ和各种mRNA翻译或转录抑制剂处理293T细胞。使用双特异性抗体通过Western blotting检测K11/K48连锁链。E.公司。新生的错误折叠蛋白质用K11/K48链修饰。使用所示抗体在变性条件下纯化来自嘌呤霉素处理的293T细胞的泛素结合物，并使用抗嘌呤霉菌素抗体检测修饰的嘌呤菌化蛋白。F、。纯化蛋白在K11/K48阳性聚集物中积累。用嘌呤霉素处理HeLa细胞2h，并通过免疫荧光显微镜对嘌呤菌素（绿色）、K11/K48链（红色）和DNA（蓝色）进行分析。右侧面板描绘了在环己酰亚胺存在下进行的相同实验的合并图像。
图4
图4。K11/K48特异性质控酶和效应物的鉴定
答：。使用K11/K48异种、K11/gD-或K48/gD-对照抗体从嘌呤霉素处理的细胞中纯化泛素链。使用5个生物重复和1个技术重复进行无标记定量质谱分析，以鉴定富含K11/K48双特异性纯化的蛋白质（与对照纯化相比，有色蛋白质显著富集；p<0.01）。与K11-（TSC）相比，轴显示富集K11/K48-TSC公司K11号公路)或K48-链路（TSCK11/K48-TSC公司K48公司)，基于平均TSC/实验。B。从经吡氟菊酯µ处理的293T细胞中亲和纯化所示拓扑的泛素链，并使用Western blotting和特异性抗体分析共纯化蛋白。如前所述，添加环己酰亚胺是为了防止新合成的蛋白质的产生。C、。p97、BAG6和p62/SQSTM1以mRNA-翻译依赖的方式结合K11/K48链。从用HSP70抑制剂pifithrinµ处理的细胞中亲和纯化内源性p97、BAG6或p62。如有指示，细胞也暴露于环己酰亚胺。使用K11/K48异特异性抗体通过Western blotting检测结合的K11/K48-连锁泛素链。D。K11/K48特异性质量控制的酶和效应器与K11/K48-阳性蛋白聚集体共定位。蛋白酶体或HSP70抑制剂处理的HeLa细胞被K11/K48链染色（红色）；通过质谱（绿色）和DNA（蓝色）鉴定的结合蛋白。
图5
图5。K11/K48特定质量控制组分的功能分析
答：。UBR4和UBR5在质量控制期间组装大多数K11/K48链式链条。293T细胞共耗尽UBR4和UBR5，用MG132处理，并用Western blotting分析不同拓扑的泛素链。B。UBR4和UBR5以嘌呤菌化蛋白为降解目标。293T细胞共耗尽UBR4和UBR5，用嘌呤霉素处理，通过环己酰亚胺追踪和Western blotting检测嘌呤菌化蛋白的稳定性。C、。UBR4和UBR5配合物合成K11/K48链在体外.内源性旗帜UBR4和旗帜UBR5从CRISPR/Cas9-edited 293T细胞中亲和纯化，与E1、E2 UBE2D3和ATP孵育（如图所示）。反应补充野生型泛素（WT）；泛素混合物K11R系列和泛素K48R公司（K11R+K48R）或双突变泛素K11R/K48R（K11R/K48R）。通过蛋白质印迹分析K11/K48连接链和相应的E3酶的反应。D。UBR5组装支链泛素链。亲和纯化旗帜UBR5与E1、UBE2D3和泛素孵育标志/TEV如αFLAG免疫印迹所示，用TEV蛋白酶处理结合物并进行分析。如果存在两个或多个FLAG-阳性标记，则表示存在分支。作为对照，使用UBE2G2/gp78进行泛素化反应，UBE2G2/gp78只组装同型K48链。E.公司。UBR5产生分支泛素三聚体。UBR5和K11特异性UBE2S与泛素孵育∆GG（一种可以修饰但不能用作修饰物的突变体）和甲基-泛素（可以转移到泛素∆GG，但未进一步修改），如图所示。通过连接特异性蛋白质印迹分析K11或K48阳性泛素结合物的形成。UBE2S和UBR5的存在导致分支泛素三聚体的形成。F、。UBR5强烈偏好K48-linkages。内源性UBR5复合物与指示的单Lys泛素突变体孵育，并通过α泛素免疫印迹分析。G.公司。UBR5产生的K11/K48支链泛素链与p97/VCP适配器NSFL1/p47的亲和力比同型K48链强。UBR5使用wt-泛素或泛素组装K11/K48支链或K48链K48公司并与固定化p97-NSFL1复合物孵育。在指定时间停止结合反应，并通过α泛素免疫印迹分析。H。蛋白酶体以嘌呤霉素化和K11/K48标记的蛋白质为降解目标。在用DMSO或MG132处理的细胞中分析嘌呤霉素化蛋白的稳定性，并使用特异性抗体通过Western blotting检测嘌呤菌素化蛋白或K11/K48连锁链。
图6
图6。K11/K48特异性质量控制目标是病理性HTT变体
a。73Q-HTT的表达，而非良性23Q-HTT的表达，导致K11/K48阳性聚集物的形成。HeLa细胞系在诱导启动子下表达23Q-或73Q-HTT与GFP融合的外显子1的结构。HTT诱导后，对细胞进行K11/K48连锁链染色（红色），GFP公司HTT（绿色）或DNA（蓝色）。右侧面板显示了从上到下的嵌件：K11/K48链，GFP公司HTT和合并。B。在未转化的人类胚胎干细胞中，73Q-HTT聚集体用K11/K48链标记。在H1 hESCs中诱导HTT后，对细胞进行K11/K48链染色（红色），GFP公司HTT（绿色）或ESC标记Nanog（蓝色）。C、。在通过长期神经转换从H1 hESCs获得的分化神经元中，用K11/K48链标记73Q-HTT聚集体。在神经元中诱导HTT后对细胞进行K11/K48连接链染色（红色），GFP公司HTT（绿色）、神经元标记Tuj1（紫色）和DNA（蓝色）。D。在亨廷顿舞蹈症小鼠模型的大脑中用K11/K48连接链标记175Q-HTT聚集体。用HTT抗体（红色）或K11/K48连锁链（绿色）染色的wt-或175Q-HTT表达小鼠脑片的最大投影。E.公司。73Q-HTT用K11/K48链进行改性。表达HIS的HeLa细胞裂解液6-对23Q-或73Q-HTT标记的外显子1进行变性NiNTA纯化，并使用链接特异性泛素抗体通过Western blotting分析结合蛋白。HTT*标记为聚集的、抗SDS的物种。输入如下所示。F、。73Q-HTT，而不是23Q-HTT-，被支链泛素链修饰。HTT变体在变性条件下纯化，包括从表达泛素的细胞中去除任何剩余的聚集体TEV/标志使用NiNTA琼脂糖。结合物用TEV蛋白酶处理在珠子上，并用αFLAG Western blotting分析分支。G.公司。73Q-HTT被K11/K48特定质量控制的效应器识别。诱导后GFP公司对73Q-HTT、HeLa细胞进行73Q-HDT（绿色）、K11/K48连锁链（黄色）、BAG6、p97、UBQLN2或p62（红色）和DNA（蓝色）染色。每个显微镜图片右侧的面板显示K11/K48链（黄色）、泛素结合物（红色）和GFP公司HTT（绿色）。
图7
图7。K11/K48特异性质量控制处理病理性HTT和新合成的错误折叠蛋白质的能力有限
答：。73Q-HTT和新生蛋白质竞争K11/K48特定质量控制机制。73Q-HTT表达后，用二甲基亚砜（对照）、MG132或吡氟菊酯µ（PIF）处理人类胚胎干细胞4-6小时，以稳定新合成的错误折叠蛋白。如前所述，添加环己酰亚胺（CHX）以测定新蛋白质合成对蛋白酶体或HSP70抑制细胞的影响。对细胞进行73Q-HTT（绿色）、K11/K48连锁链（红色）或hESC标记Nanog（蓝色）染色。右侧面板从上到下显示了嵌件的以下通道：K11/K48链和73Q-HTT的合并；K11/K48链；73Q-HTT。B。用DMSO（对照）、MG132或MG132和环己酰亚胺（MG132/CHX）处理的人胚胎干细胞中K11/K48阳性HTT聚集体的定量。仅统计K11/K48染色的完全丧失（即染色减少仍被视为阳性聚集物）。（HTT+：所有HTT骨料；HTT公司+/K11/K48+：K11/K48-正HTT骨料）。描述了三个生物重复的平均值-/+s.e.m.，并通过非配对t检验确定显著性（**p<0.005）。C、。73Q-HTT和新生蛋白竞争K11/K48特异性质量控制的效应器。在诱导73Q-HTT表达后，用DMSO（对照）、MG132或MG132/环己酰亚胺（CHX）处理人胚胎干细胞。对细胞进行73Q-HTT（绿色）、K11/K48连接链（红色）、K11/K48效应物BAG6或UBQLN2（紫色）和DNA（蓝色）染色。右侧面板从上到下显示了插件的以下通道：BAG6或UBQLN2（紫色）；K11/K48链（红色）；73Q-HTT（绿色）。D。BAG6的消耗导致更多HTT聚集物。使用siRNAs去除人胚胎干细胞中的BAG6，并用强力霉素处理以诱导73Q-HTT的表达。通过随机图像采集和图像J分析确定73Q-HTT聚集体的数量。描述了四个生物重复的平均值-/+s.e.m，并通过配对t检验确定显著性。（*：p<0.05）。E.公司。 上部面板：有丝分裂期间K11/K48支链形成模型。APC/C及其特定E2酶UBE2C和UBE2S产生K11/K48支链共轭物，其特征是K11链的多个区块。如前所示（Meyer和Rape，2014），这种链有效地触发了细胞周期调节器的蛋白酶体降解。下部面板：K11/K48特定质量控制模型。新合成的错误折叠蛋白最初被伴侣识别，包括HSP90和BAG6。如果多次折叠失败，则E3连接酶UBR4和UBR5会识别这些错误折叠的蛋白质，并用K11/K48支链修饰其靶点。泛素选择性分离酶p97/VCP和UBQLN家族的蛋白酶体梭识别K11/K48泛素化底物。这导致它们从蛋白质复合物中去除，并传递到蛋白酶体进行降解，从而防止蛋白质聚集。HTT的病理变异与新合成的错误折叠蛋白质竞争，以获得有限的酶池和K11/K48特异性质量控制的效应器。
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中的注释

  • 异型泛素链：眼见为实。
    Stolz A，Dikic I。 Stolz A等人。 趋势细胞生物学。2018年1月；28(1):1-3. doi:10.1016/j.tcb.2017.11.005。Epub 2017年11月27日。 趋势细胞生物学。2018 PMID：29191367

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