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.2017年10月19日；171（3）：573-587.e14。
doi:10.1016/j.cell.2017.09.018。 Epub 2017年10月12日。

基因组-核膜相互作用调节心脏干细胞世系限制

安德烈·波列斯科 1, 帕里沙·沙阿 1, 穆迪特·古普塔 1, Apoorva巴布 1, 迈克尔·P·莫利 1, 劳伦·曼德菲尔德 1, 杰米·利夫科维茨 1, 达梅利斯·卡尔德隆 2, 黑格·阿加贾尼安 1, 哈维尔·西耶拉·帕根 1, 郑孙 三, 王巧红 1, 李丽 1, 妮科尔·迪布瓦 2, 爱德华·莫里西 1, 米切尔·拉扎尔 三, 谢丽尔·史密斯 1, 乔纳森·爱泼斯坦 4, 拉詹·贾因 5
附属公司

基因组-核膜相互作用调节心脏干细胞世系限制

安德烈·波列斯科等。 单元格. .

摘要

通过谱系特异性基因的协调表达和复杂染色质结构的修饰，祖细胞分化为专门的细胞类型。我们证明，在心脏祖细胞谱系限制期间，组蛋白去乙酰化酶（Hdac3）在核层组织异染色质。心肌细胞的特异性与外周异染色质的重组有关，并且与脱乙酰酶活性无关，Hdac3将含有谱系相关基因的外周异染色质连接到核纤层。心脏祖细胞中Hdac3的缺失从核外周释放基因组区域，导致早熟心脏基因表达并分化为心肌细胞；相反，将Hdac3限制在核外周可以拯救缺乏Hdac3.的祖细胞的肌发生。我们的结果表明，谱系特异性因子激活基因组区域的可用性部分通过动态染色质-核膜相互作用进行调节，祖细胞对分化信号的反应能力可能取决于反应基因位点远离核外周的协调运动。

关键词：心脏规格；细胞能力；基因组组织；谱系限制；核纹层。

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数字

图1
图1。Hdac3抑制心脏祖细胞向心肌细胞的分化
（A） 小鼠胚胎干细胞心脏分化为多能干祖细胞的图式，可产生指定的分化细胞类型。（B） 第8天通过流式细胞仪测量的每种细胞类型的百分比。分化第5天过度表达Hdac3（载体+Hdac3-Flag）的细胞显示Tnnt2+CM减少；他莫昔芬介导Hdac3型缺失（他莫昔芬+GFP）增加了Tnnt2+CMs的数量。（C） 转导后总Hdac3和负荷控制（β-actin）的免疫印迹CMV-creERT；Hdac3型飞行/飞行GFP控制的ESCs或使用载体或他莫昔芬治疗的Hdac3构建的ESCs。（D） 第8天三苯氧胺介导的基因表达数据的GO分析Hdac3型与对照培养物相比，缺失可确定与Hdac3功能丧失相关的心肌特异性GO术语。（E） 从（D）中GO项中选择的候选基因相对于Gapdh公司.（F）他莫昔芬介导的模式Hdac3型分化第7天时缺失。（G） 他莫昔芬介导Hdac3型从心脏分化第7天开始的缺失显示，与载体相比，流式细胞术在第8天测得的每种细胞类型的百分比没有差异。（H） 他莫昔芬介导的模式Hdac3型野生型或突变体结构在分化第5天的缺失和转导。（一） Tnnt2的百分比+在第8天通过流式细胞术测量的CMs（在第5天用三苯氧胺处理并用野生型Hdac3或Hdac3Y298H突变体转导的细胞）。数据表示（B、E、G、I）的平均值±SEM，n≥3次重复。（B，I）通过单向方差分析，采用Tukey事后检验。（E，G）用双尾Student t检验分析；统计比较是针对车辆的。*p<0.05。见图S1，表S1。
图2
图2。心脏发生过程中细胞膜染色质的重组
（A） Hdac3与核外围组件相互作用模型；ONM：外核膜；INM：内核膜。（B） 转染有指示结构的293T细胞的co-IP和输入裂解物的免疫印迹；IP：用于免疫沉淀的抗体；IB：用于免疫印迹的抗体。（C） LaminB1 DamID的代表性基因组轨迹（Peric-Hupkes等人，2010）和来自ESCs的输入正常化Lamin B ChIP-seq。灰色框中的区域在较低的一组轨迹中被放大。黑色条表示EDD定义为LAD的区域。（D） 使用LaminB ChIP-seq和LaminB1 DamID在LAD中定义的基因重叠（Peric-Hupkes等人，2010年）。（E） 比较ESCs和CM中LAD和非LAD区域基因的标准化log2基因表达（Wamstad等人，2012）（Tukey置信区间的中位数表达）。（F） 堆积条形图：与ESC相比，在CM中获得、保留或失去LAD居住地的基因数量。（G） 来自ESC和CM的LaminB ChIP-seq轨迹显示心脏基因Ace2公司与ESC相比，在CM的LAD中失去居住权；黑色条：LAD。（H） 与来自多能干细胞、内皮细胞和内皮细胞的基因集签名以及随机基因集签名相比，ESCs和CM之间肌细胞签名基因的Lamin B接触频率的变化；n=每组中的基因数量；p： 通过单因素方差分析Kruskal-Wallis检验分析每个基因集与心肌细胞基因相比的折叠变化差异的显著性。参见图S2、表S2、S3。
图3
图3。H3K9me2标记外周异染色质
（A） 指定细胞类型的H3K9me2和Lamin B（Lmnb）免疫染色。底行突出显示的虚线框中的区域。（B） 所示细胞类型中核膜上H3K9me2标记染色质层的深度。在每种细胞类型中测量的30个位置，图中显示了Tukey置信区间的中值距离。采用单因素方差分析Kruskal-Wallis检验进行分析。（C，D）H3K9me2（C）或H3K9 me3（D）以及LaminB IF和多能干ESCs图像Z堆栈的3D重建；比例尺：2.5µm。（E） 具有抑制染色质标记和层粘连蛋白B的骨骼肌成肌细胞的IF。见图S3，表S4。
图4
图4。H3K9me2标记的染色质反映薄层结合染色质
（A） ESC的代表性H3K9me2和LaminB ChIP-seq轨道（第3章）。黑色条表示LAD。灰色框中的区域在顶部轨迹集下方放大。（B） 10kb垃圾桶基因组中LaminB与H3K9me2占有率的相关性；皮尔逊相关系数r=0.84。（C） LAD和H3K9me2结构域中的基因重叠。（D） ESC和CM中H3K9me2结构域和非H3K9 me2区域基因的标准化log2基因表达分布（Wamstad等人，2012）；Tukey置信区间的中值表达；通过单因素方差分析Kruskal-Wallis检验确定显著性。（E） 与ESC相比，CMs中获得、保留或失去H3K9me2结构域的基因数量。（F） ESC和CM中的H3K9me2 ChIP-seq轨道，突出显示坦桑尼亚联合酋长国与ESC相比，CM中失去H3K9me2域（黑条）的居住权。见图S4，表S2。
图5
图5。心脏分化期间，心脏基因从核板释放
（A–C）免疫染色（A）和3D重建（B，C）显示坦桑尼亚联合酋长国ESC中与核膜和H3K9me2标记染色质相关的位点。（D） 3D重建显示坦桑尼亚联合酋长国与CM核层相关的位置。（C，D）中的底部面板是放大倍率较高、轻微旋转的图像，显示了每一个的距离坦桑尼亚联合酋长国叶片等位基因（Lmnb）。坦桑尼亚联合酋长国在CM中距离核外围更远（C对D）。（E） LaminB（Lmnb）共染色的每种细胞类型中指示基因座（红色）的免疫FISH。免疫荧光图像附近显示的每个基因座每个细胞的等位基因数量；根据每个位点的条件，对20–30个细胞进行量化。阈值：见方法。（F） 如图所示，对每种细胞类型中的单个位点进行距离（E）量化。比例尺：（A，B）0.5µm；（C–E）5µm.*p<0.001。采用（E）Fisher精确检验进行统计比较；（F） Tukey事后检验的单因素方差分析，参考Kcnc2公司基因座。见图S5，表S5。
图6
图6。Hdac3需要在核纹层保留候选位点
（A） 中指示位点（红色）的免疫荧光CMV-creERT；Hdac3型飞行/飞行ESCs用载体或三苯氧胺处理，并与LaminB（Lmnb）共同染色。心脏基因(Ttn、Actc1、Calca)三苯氧胺介导的核外周早熟释放Hdac3型删除。每个基因座每个细胞核膜上等位基因数量的评分与免疫荧光图像相邻；对每种情况下每个基因的20–30个细胞核进行量化。阈值：见方法。（B） 免疫-FISH（A）中观察到的在每个治疗条件下以单个位点为基础的核板距离定量显示心脏基因位点在Hdac3型删除。（C） 指定Hdac3构造本地化的IF（Flag）；Lap2β融合将Hdac3连接到核外围；Hdac3Δ33-70失去外围定位；配对图像的右面板是左面板中方框区域的放大倍数较高的区域。（D） 免疫荧光行动1在里面CMV-creERT；Hdac3型飞行/飞行ESCs，Lmnb共染，用载体或三苯氧胺处理，并显示Hdac3结构；除Hdac3Δ33-70外，所有Hdac2均构建了救援位点定位。（E） 每细胞核膜等位基因的评分行动1根据（D）的条件和构造；对每种情况下的20–30个细胞进行量化。阈值：见方法。（F） 以个体基因座为基础量化的免疫-FISH（D）。比例尺：5µm。*p<0.01。通过Fisher精确检验分析（A，E）中的统计比较。用Student t检验对（B）进行统计比较，用Tukey事后检验对（F）进行单向方差分析；参照车辆处理进行比较。见图S6，表S5。
图7
图7。Hdac3需要与核纤层相互作用以抑制心脏分化
（A） 分化第5天用三苯氧胺同时介导的Hdac3结构的模式Hdac3型删除。（B） Tnnt2的百分比+用流式细胞术检测含载体或三苯氧胺及指示结构的细胞分化第8天的心肌细胞；所有Hdac3建造救援Hdac3型除Hdac3Δ33-70外，早发性心脏病表型缺失。（C） CM基因的基因表达分析（qRT-PCR）和Hdac3型从第8天的细胞开始，使用载体或三苯氧胺和指定的构建物；除Hdac3Δ33-70外，所有构建物均能拯救心脏基因表达。数据表示平均值±SEM，n≥3次重复（B）、（C）。*p<0.05，所有统计比较均为车辆+GFP对照，采用Tukey事后检验进行单向方差分析。（D） 多能干细胞的分化依赖于Hdac3，以协调包含核膜谱系特异性位点的基因组区域的同步释放。Hdac3将染色质固定在叶片上。如果没有Hdac3，心肌特异性基因会与核层失去联系，在H3K9me2标记的外周异染色质层中发现的频率较低，并且更有可能是转录活性的。
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