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.2017年10月13:6:e31268。
doi:10.7554/eLife.31268。

二甲双胍延伸秀丽线虫通过溶酶体途径延长寿命

陈杰（音译） # 1 2, 欧玉辉 # 1, 李毅 1 2, 胡舒梅 1 2, 李华韶 1 2, 刘莹（音） 1
附属公司

二甲双胍延伸秀丽线虫通过溶酶体途径延长寿命

陈杰（音译）等。 埃利夫. .

摘要

二甲双胍是一种广泛用于治疗2型糖尿病（T2D）的一线药物，已被证明可以延长寿命并延缓与年龄相关的疾病的发病。然而，其主要作用地点仍不清楚。使用纯体外重建系统，我们证明二甲双胍通过v-ATPase-Ragulator溶酶体途径发挥作用，以协调mTORC1和AMPK这两个控制代谢程序的中枢。我们进一步展示了秀丽隐杆线虫v-ATPase介导的TORC1抑制和v-ATPase-AXIN/LKB1介导的AMPK激活都有助于二甲双胍的寿命延长效应。阐明二甲双胍调节健康寿命延长的分子机制将促进其在治疗人类衰老和年龄相关疾病中的应用。

关键词：AMPK；秀丽线虫；细胞生物学；mTOR；二甲双胍。

PubMed免责声明

利益冲突声明

没有宣布竞争利益。

数字

图1。
图1.二甲双胍在纯化溶酶体上协调mTORC1和AMPK。
(A类)机械破碎稳定表达LAMP1-RFP-FLAG的HEK293T细胞。(B类)溶酶体通过免疫沉淀纯化（器官标记：LAMP2，溶酶体；EEA1，早期内体；Probitin，线粒体；PDI，ER；组蛋白H3，细胞核）。(C类)氨基酸刺激后纯化Myc-受体的溶酶体积累。(D–E型)Myc猛禽的溶酶体解离(天)Myc-AXIN/LKB1的溶酶体积累和AMPK的磷酸化(E类)经甲壳霉素A（Con A）或二甲双胍（Met）治疗。(F–H（飞行高度）)免疫印迹定量(C–E类). 将Myc-Captor、Myc-AXIN和Myc-LKB1的免疫印迹归一化为LAMP-RFP-FLAG的免疫印记，并将p-AMPK的免疫印痕归一化至AMPK。三个独立生物重复的相对强度显示为平均值±SEM。ns，无显著差异*p<0.05**p<0.01***p<0.001。
图1——图补充1。
图1-图补充1。二甲双胍独立于AMPK抑制mTORC1。
(A类)机械破碎稳定表达LAMP1-RFP-FLAG的AMPKα1/2双敲除细胞。(B类)溶酶体通过免疫沉淀纯化（器官标记：LAMP2，溶酶体；EEA1，早期内体；Probitin，线粒体；PDI，ER；组蛋白H3，细胞核）。(C类)氨基酸刺激后纯化Myc-受体的溶酶体积累。(D–E型)Myc-受体溶酶体解离(天)以及Myc-AXIN/LKB1的溶酶体积累(E类)经甲壳霉素A（Con A）或二甲双胍（Met）治疗。(F–H（飞行高度）)免疫印迹定量(C–E类). 将Myc-Captor、Myc-AXIN和Myc-LKB1的免疫印迹归一化为LAMP-RFP-FLAG的免疫印记，并将p-AMPK的免疫印痕归一化至AMPK。三个独立生物重复的相对强度显示为平均值±SEM。ns，无显著差异*p<0.05**p<0.01***p<0.001。
图1—图补充2。
图1-图补充2纯化的Myc-LKB1与内源性STRAD和MO25形成复合物。
图1——图补充3。
图1补充图3二甲双胍靶向溶酶体线虫.
(A类)线粒体应激反应报告菌株的代表性荧光图像hsp-6p:：绿色荧光蛋白在正常条件下培养，或在二甲双胍或鱼藤酮存在下培养。(B类)中荧光图像的量化(A类). 显示了3个独立生物复制品的平均值±SEM（样本大小：≥40条蠕虫）。(C类)使用或不使用二甲双胍对蠕虫进行魔红组织蛋白酶检测的代表性荧光图像。(天)荧光图像的量化(C类). 显示了3个独立生物复制品的平均值±SEM（样本大小：≥40条蠕虫）。比例尺：100μm.ns，无显著差异*p<0.05**p<0.01***p<0.001。
图2。
图2二甲双胍抑制TORC1通路线虫.
(A类)存在或不存在二甲双胍时RSKS-1磷酸化的代表性western blotting。(B类)免疫印迹定量(A类). 3个独立生物重复的相对强度显示为平均值±SEM。(C类)有无二甲双胍时HLH-30细胞核定位的典型荧光图像。(天)HLH-30核定位的蠕虫百分比(C类)被量化。显示了3个独立生物复制品的平均值±SEM（样本大小：≥40条蠕虫）。(E类)在有无二甲双胍的情况下对HLH-30靶基因进行Q-PCR分析。每个样本中聚集了约300条蠕虫。来自三个独立生物复制的数据显示为平均值±SEM。ns，无显著差异*p<0.05**p<0.01***p<0.001。
图2——图补充1。
图2——图增补1..RSKS-1，线虫S6K1的同源物在T389残基处磷酸化。
(A类)S6K1的T389在物种间高度保守。利用MEGA6绘制了不同物种S6K1蛋白序列的ClastW。(B类)rsks-1RNAi降低野生型动物的RSKS-1磷酸化水平。
图2——图补充2。
图2-图补充2.二甲双胍抑制TORC1，不依赖于AMPK线虫.
(A类)野生型HLH-30细胞核定位的典型荧光图像aak-2型存在或不存在二甲双胍的突变动物。(B类)HLH-30核定位的蠕虫百分比(A类)被量化。显示了3个独立生物复制品的平均值±SEM（样本大小：≥40条蠕虫）。(C类)HLH-30靶基因的Q-PCR分析aak-2型使用或不使用二甲双胍治疗的突变体。每个样本中聚集了约300条蠕虫。来自三个独立生物复制的数据显示为平均值±SEM。ns，无显著差异*p<0.05**p<0.01***p<0.001。
图3。
图3二甲双胍部分由于TORC1抑制而延长健康寿命。
(A类)控制蠕虫或daf-15型存在或不存在二甲双胍的杂合突变体。(B类)控制蠕虫或daf-15型存在或不存在二甲双胍的杂合突变体。(C类)量化(B类). 误差条表示3个独立生物复制品的平均值±SEM（样本大小：n≥40条蠕虫）。(D–E型)运动(天)和老化颜料(E类)在控制蠕虫或daf-15型存在或不存在二甲双胍的杂合突变体。显示了3个独立生物重复的平均值±SEM（样本量：n≥20只蠕虫用于运动测定；n≥40只蠕虫用于年龄色素测定）。(F类)HLH-30细胞核在对照蠕虫或daf-15型存在或不存在二甲双胍的杂合突变体。箭头表示核局部HLH-30:：GFP。(G公司)量化(F类). 百分比unc-24号机组/+; HLH-30:：GFP或unc-24/daf-15; 对HLH-30：：具有HLH-30核聚积的GFP蠕虫进行计数。误差条表示3个独立生物复制品的平均值±SEM。（样本量：n≥40个蠕虫）(H（H）)有无二甲双胍时AAK-2磷酸化的典型western印迹。(我)量化(H（H）).~每个蛋白质样本中汇集了300条蠕虫。误差条表示3个独立生物复制品的平均值±SEM。ns，无显著差异*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图3——图补充1。
图3-图补充件1.删除daf-15型抑制TORC1活性。
(A类)的生成达夫-15杂合突变体及其相应的对照动物。(B类)N2或daf-15型杂合突变体。(C类)免疫印迹定量(B类). 3个独立生物重复的相对强度显示为平均值±SEM。(天)健康跨度参数检测的实验设计示意图。ns，无显著差异*p＜0.05**p<0.01***p<0.001。
图3——图补充2。
图3-图补充2.二甲双胍通过一种途径增加TORC1抑制，从而延长寿命。
(A–C)寿命分析hlh-30型,第4阶段或skn-1号机组二甲双胍存在或不存在时功能丧失突变。
图4。
图4二甲双胍通过v-ATPase-Ragulator-dependent激活AMPK延长寿命。
(A类)描述体内基因的方案秀丽线虫TORC1和AMPK途径。(B–C类)野生型的寿命分析，vha-3型(B类)，或lmtr-3型(C类)有或没有二甲双胍的动物。(天)对照蠕虫HLH-30核定位的代表性荧光图像，vha-3型或lmtr-3型RNAi。(E类)量化(天)，具有HLH-30核聚积的蠕虫百分比。显示了3个独立生物复制的平均值±SEM（样本大小：n≥40条蠕虫）。(F类)用Q-PCR分析对照虫体内HLH-30靶基因，vha-3型或lmtr-3型RNA干扰。每个mRNA样本收集约300条蠕虫。来自3个独立生物复制的数据显示为平均值±SEM。(G公司)与对照组一起给药的蠕虫中RSKS-1磷酸化的代表性免疫印迹，vha-3型或lmtr-3型RNAi。(H（H）)量化(G公司).~每个蛋白质样本中汇集了300条蠕虫。3个独立生物重复的相对强度显示为平均值±SEM。(我)野生型AAK-2磷酸化的代表性免疫印迹，vha-3型或lmtr-3型突变，在二甲双胍存在或不存在的情况下。(J型)量化(我).~每个蛋白质样本中收集了300条蠕虫。3个独立生物重复的相对强度显示为平均值±SEM。ns，无显著差异*p<0.05**p<0.01***p<0.001。
图4——图补充1。
图4补充图1.v-ATP酶和Ragulator突变体的基因分型。
(A类)描述每个突变体中缺失和PCR引物位置的方案。(B类)基因分型引物序列。(C类)基因分型PCR结果。
图4——图补充2。
图4-图补充2线虫v-ATPase-Ragulator蛋白。
(A–D)测试VHA-3、VHA-12、LMTR-2或LMTR-3与LMP-1共同定位的代表性荧光图像。L1蠕虫在二甲双胍存在或不存在的情况下培养至L4期。比例尺：10 um。
图4——补充图3。
图4补充图3：v-ATPase或Ragulator突变干扰溶酶体功能线虫.
(A类)野生型魔红组织蛋白酶分析的代表性荧光图像，vha-3型,vha-12型,lmtr公司-2，或线性矩阵变换器-3个功能丧失突变体，以及vha-3型,vha-12型,线性矩阵变换器-2，或线性矩阵变换器-3个功能丧失突变体注射相应的拯救质粒。比例尺：100 um(B类)量化(A类). 误差条表示3个独立生物复制品的平均值±SEM（样本大小：n≥40）。ns，无显著差异*p<0.05**p<0.01***p<0.001。
图4——补充图4。
图4补充图4。二甲双胍通过v-ATPase-Ragulator-dependent AMPK激活延长寿命。
(A–B)野生型寿命测定，vha-12型(A类)，或lmtr-2型突变体(B类)在二甲双胍存在或不存在的情况下。(C–D类)的拆卸效率vha-3型(C类)或vha-12型RNA干扰(天). (E类)N2中AAK-2磷酸化的代表性免疫印迹，vha-12型，或lmtr-2型用二甲双胍或不用二甲双胍处理的突变体。(F类)量化(E类).~每个蛋白质样本中汇集了300条蠕虫。p-AAK-2的强度归一化为微管蛋白的强度，3个独立的生物复制品的相对强度显示为平均值±SEM。(G公司)在N2的寿命分析过程中，对由于外阴爆破而引起的被切除的蠕虫进行计数，lmtr-3型或lmtr-2型二甲双胍存在或不存在的蠕虫。误差条表示两个独立生物复制品的平均值±SEM（样本大小：~100个N2蠕虫；~250个lmtr-2型/三突变体）。ns，无显著差异*p<0.05**p<0.01***p<0.001。
图5。
图5二甲双胍延长寿命轴-1-AMPK的依赖性激活。
(A类)用于测试AXL-1与LAMP1共同定位的代表性荧光图像。稳定表达AXL-1-EGFP和LAMP1-RFP-FLAG的HEK293T细胞在有或无2 mM二甲双胍的条件下培养12小时。比例尺：10 um(B类)野生型蠕虫或轴-1突变体。比例尺：100 um。误差条代表3个独立生物复制品的平均值±SEM（样本大小：n≥40）。(C类)野生型或野生型AAK-2磷酸化的代表性免疫印迹轴-1使用或不使用二甲双胍治疗的突变体。(天)量化(C类).~每个蛋白质样本中汇集了300条蠕虫。3个独立生物重复的相对强度显示为平均值±SEM。(E–F)野生型的寿命分析，轴-1(E类)，或第4部分突变体(F类)在二甲双胍存在或不存在的情况下。ns，无显著差异*p<0.05**p＜0.01***p<0.001。
图6。
图6.二甲双胍通过溶酶体依赖性AMPK激活来减弱与年龄相关的适应性下降。
中性脂肪沉积(A–B)，移动(C–F类)和老化颜料(G公司)在野生型蠕虫中进行测量，或vha-3型,lmtr-3型或轴-1二甲双胍存在或不存在的突变体。误差条表示3个独立生物复制品的平均值±SEM。（样本量：n≥20条蠕虫用于运动分析；n≥40条蠕虫进行ORO染色或年龄色素分析）。(H（H）)二甲双胍可靶向v-ATPase-Ragulator复合物，并通过协调总工程师。TORC1和总工程师。AMPK公司。
图6——图补充1。
图6-图补充1。二甲双胍作用的拟议模型。
在正常条件下，v-ATP酶是一种活性构象，它介导溶酶体氨基酸信号来招募和激活TORC1。二甲双胍治疗可能靶向v-ATP酶并改变其构象，导致TORC1的解离和失活。同时，v-ATPase-Regulator可作为AXIN/LKB1对接和随后激活AMPK的平台。
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