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.2018年9月;28(5):611-630.
doi:10.1111/bpa.12571。 Epub 2017年12月26日。

氧化应激和线粒体动力学障碍与Pelizaeus-Merzbacher病相关

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氧化应激和线粒体动力学障碍与Pelizaeus-Merzbacher病相关

蒙特塞拉特·鲁伊斯等。 大脑病理学. 2018年9月.

摘要

Pelizaeus-Merzbacher病(PMD)是一种致命的低髓鞘性疾病,其特征是运动发育早期受损、眼球震颤、舞蹈症运动、共济失调和进行性痉挛。PMD是由蛋白脂蛋白基因PLP1的变异引起的,PLP1编码少突胶质细胞中中枢神经系统的两种主要髓鞘蛋白PLP及其剪接异构体DM20。包括整个PLP1基因在内的大量重复是导致PMD经典形式的最常见诱因突变。Plp1过表达小鼠模型(PLP-tg第66页,共66页)发展出与人类PMD非常相似的表型,早期和严重的运动功能障碍,寿命显著缩短。导致神经退化并最终死亡的细胞事件的顺序尚不清楚。在这项工作中,我们分析了患者来源的PLP-tg成纤维细胞和脊髓66/66小鼠模型,确定氧化还原失衡,抗氧化防御发生改变,对参与ATP生成的几种酶造成氧化损伤,如糖酵解酶、肌酸激酶和来自克雷布斯循环和氧化磷酸化的线粒体蛋白。我们还证明了线粒体室功能失常,PMD患者成纤维细胞中ROS生成增加和去极化,而抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸阻止了这一现象。最后,我们发现患者成纤维细胞线粒体动力学受损,这可能有助于解释PLP-tg检测到的脊髓线粒体形态的超微结构异常66/66老鼠。总之,这些结果强调了髓磷脂疾病中氧化还原和代谢稳态之间的联系,为PMD的病理生理学提供了见解,并可能对量身定制的药物干预产生影响。

关键词:Pelizaeus-Merzbacher病;抗氧化剂;生物能量衰竭;线粒体动力学;氧化应激。

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数字

图1
图1
6周龄野生型和Plp1过度表达(PLP‐tg)的白质颈脊髓的神经病理学分析66/66)老鼠.WT的700纳米半薄环氧树脂嵌入颈脊髓切片(A类)和PLP‐tg66/66(B类)甲苯胺蓝染色的小鼠。腹柱白质100倍长度处拍摄的照片(A类B类). 用WT的乙酸铀酰和柠檬酸铅染色的70纳米超薄切片(C类E类)和PLP‐tg66/66(D类F类)取自同一块而非半薄切片。WT切片的电子显微照片(C类)和PLP‐tg66/66(D类)放大倍数×25 000,来自WT(E类)和PLP‐tg66/66(F类)放大倍数×50 000。PLP‐tg中经常观察到大型无髓鞘轴突66/66老鼠(B类D类). 值得注意的是,当髓磷脂被保存时,薄片表现出正常的致密性和周期性,但厚度减少(黑色填充箭头;D类F类). PLP‐tg中发现线粒体密度或大小增加66/66少突胶质细胞,一些线粒体出现退化(黑色空箭头;D类). 在3 WT和3 PLP‐tg中进行的量化66/66证实了PLP‐tg中轴突和少突胶质细胞胞浆的增大66/66以及线粒体大小和数量的增加。采用双向方差分析进行统计分析*P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01; ***P(P) < 0.001.
图2
图2
6周龄野生型和Plp1过度表达(PLP‐tg)的灰质颈脊髓的神经病理学分析66/66)老鼠.来自WT的700纳米半薄环氧树脂嵌入颈脊髓切片(A类)和PLP‐tg66/66(B类)甲苯胺蓝染色的小鼠。在100×长灰质中间带拍摄的照片(A类B类). 用WT的乙酸铀酰和柠檬酸铅染色的70纳米超薄切片(C类E类)和PLP‐tg66/66(D类F类)取自同一块而非半薄切片。WT切片的电子显微照片(C类)和PLP‐tg66/66(D类)放大倍数×25 000,来自WT(E类)和PLP‐tg66/66(F类)放大倍数×50 000。在WT小鼠中观察到许多小轴突束沿口-尾方向排列良好,并有明显的髓鞘;这些轴突在PLP‐tg中无髓鞘第66页,共66页老鼠(黑色填充箭头;A类B类). 电子显微镜分析也显示PLP‐tg灰质中一些线粒体的大小急剧增加第66页,共66页小鼠,许多也表现出异常的嵴形态(黑色空箭;D类). 在3 WT和3 PLP‐tg中进行的量化第66页,共66页证实了PLP‐tg中轴突和少突胶质细胞胞浆的增大66/66以及线粒体大小和数量的增加。采用双向方差分析进行统计分析*P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01; ***P(P) < 0.001.
图3
图3
6周龄时,PLP‐tg66/66脊髓中的MtDNA和蛋白质水平增加2周龄和6周龄小鼠的mtDNA含量表示为mtDNA(cytb)与核DNA(CEBP)的比值(A类). 6周龄小鼠中CxI亚单位NDUFA9和NDUFB8、CxII、CxIII、CxIV、CxV、VDAC、ACO2和DLDH蛋白的表达(B类). 相对基因表达Pgc公司Tfam公司编号1编号2裂开140在6周大的小鼠中(C类). 6周龄小鼠脊髓DRP1、Fis1、OPA1和MFN2的相对蛋白表达(D类). 显示了具有代表性的斑点。蛋白质水平表示为对照组的倍数增加,并参考γ微管蛋白作为负荷标记物。两周龄小鼠n = 7/基因型;6周龄小鼠,体重n = 6,PLP‐tg66/66n个 = 7.CTL成纤维细胞 = 4;产品生命周期1‐复制PMD成纤维细胞n = 4.数值表示为平均值±SD.使用Student’st吨‐测试*P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01, ***P(P) < 0.001.
图4
图4
在6周龄的PLP‐tg中鉴定出21个明显氧化的蛋白质第66页,共66页脊髓中的小鼠.答:。对6周龄的PLP‐tg进行氧化还原蛋白质组学实验第66页,共66页和他们匹配的WT小鼠。用抗二硝基苯肼抗体在不同时间暴露于化学发光反应中进行Western blot检测氧化蛋白(n = 3/基因型)。B。通过Western blot检测脊髓中的所有非线粒体氧化蛋白均正常表达。相对蛋白质水平表示为对照组的百分比,并参考γ微管蛋白作为负荷标记物(n = 6/基因型)。数值以平均值表示±SD.学生t吨‐测试用于统计分析;P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01, ***P(P) < 0.001.
图5
图5
Plp1过度表达会干扰6周龄PLP‐tg大鼠脊髓的能量代谢66/66老鼠.ATP水平降低(A类)PK增加(B类)在PLP‐tg中66/66.AAT没有显著增加(C类). 活性以单位/mg组织表示。重量(n = 6) 和PLP‐tg66/66小鼠(n = 7) 用于研究。数值以平均值表示±SD.学生t吨‐测试用于统计分析***P(P) < 0.001, **P(P) < 0.01, *P(P) < 0.05.
图6
图6
6周龄PLP‐tg大鼠脊髓抗氧化防御能力发生改变66/66老鼠.抗氧化酶RNA(A类)和蛋白质(B类)水平和GR活动(C类)在6周龄WT和PLP‐tg的脊髓中测定第66页,共66页小鼠(n = 7/基因型)。RNA通过TaqMan实时PCR定量。相对蛋白质水平表示为对照组的百分比,并将γ微管蛋白作为负荷标记物。谷胱甘肽还原酶活性以单位/mg组织表示。数值以平均值表示±SD.学生t吨‐测试用于统计分析*P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01, ***P(P) < 0.001.
图7
图7
PLP1重复的PMD患者神经和皮肤成纤维细胞中PLP‐DM20 mRNA的定量直方图表示控制和产品生命周期1复制病人神经(A类)和成纤维细胞(B类). 图表表示为每个产品生命周期1复制病人神经(B类)和成纤维细胞(D类)以及使用患者和对照组的比率通过ROC曲线确定的病理阈值(粗体线)。疾病的严重程度为:三角形表示形式1,方形表示形式2,菱形表示形式3*提到患者在成纤维细胞和周围神经方面的结果(C类D类). 通过非参数Wilcoxon检验进行统计分析(A类B类); *P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01; ***P(P) < 0.001.
图8
图8
NAC可预防人PMD成纤维细胞的线粒体功能障碍.细胞内过氧化物水平(DCF探针)(A类); 细胞内(DHE探针)和线粒体(MitoSOX探针)超氧化物水平(B类); 线粒体内膜电位(C类); 线粒体呼吸(D类)、和ATP含量(E类)在接受或不接受NAC治疗的人类对照组和PMD成纤维细胞(n = 4/基因型)。C类,线上的数值对应于24小时内NAC(100μM)治疗后Pelizaeus‐Merzbacher病成纤维细胞中去极化细胞的百分比。DCF = 二氯荧光素 = 二氢乙炔,TMRE = 四甲基罗丹明乙酯 = 控制,PMD = Pelizaeus‐Merzbacher病。数值以平均值表示±SD。通过单向方差分析和Tukey's HSD进行统计分析事后(post-hoc)(A类C类E类)和学生的t吨‐测试(B类D类); *P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01; ***P(P) < 0.001.
图9
图9
裂变刺激对人PMD成纤维细胞线粒体动力学的影响DRP1、Fis1、OPA1和MFN2在人类对照和产品生命周期1‐复制PMD成纤维细胞(A类). 暴露于血清耗竭8小时或CCCP(200μM)1小时后,用共焦显微镜观察带有抗Tom20抗体和DAPI(细胞核)的染色对照和PMD成纤维细胞(B类). 下部面板显示了上述面板中白色方框的放大区域。比例尺:10 uM。数字图像通过美国国立卫生研究院开发的IMAGEJ软件进行卷积滤波,以隔离和均衡图像中的荧光像素。阈值化后,分析单个颗粒(线粒体)的直径、平均大小和圆度。下部面板显示软件处理的图像(黑白)。共20个细胞(n = 3 Ctrl和n = 3 PMD)对每种情况进行检查。通过单向方差分析和Tukey's HSD进行统计分析事后(post-hoc); *P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01.

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