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.2017年10月12日；8(1):877.
doi:10.1038/s41467-017-01029-x。

EZH2通过CDKN1A和Rb-E2F1反馈环的表观遗传沉默实现生发中心的形成

温迪·贝盖林 1, 马丁·里瓦斯 2, 玛丽亚·塔尔沃·费尔南德斯 2, 马特·泰特 2 三, 阿尔贝托·普瓦达 4, 大卫·雷德蒙德 三 5, 郝深 2, 马特·查尔曼 2, Olivier Elemento公司 三, 安库尔·辛格 6 7, 阿里·梅尔尼克 8
附属机构

EZH2通过CDKN1A和Rb-E2F1反馈环的表观遗传沉默实现生发中心的形成

温迪·贝盖林等。 国家公社. .

摘要

EZH2组蛋白甲基转移酶是B细胞形成生发中心（GC）所必需的。这里我们证明EZH2通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂CDKN1A（p21）介导GC的形成Cip1号机组). 删除Cdkn1a可挽救Ezh2中的GC反应-/-老鼠。使用模拟GC反应的3D B细胞滤泡类有机物系统，我们表明EZH2的缺失以Cdkn1a依赖的方式抑制GC B细胞的G1-S相转变。Cdkn1a的GC B细胞-/-鄂尔多斯2-/-小鼠的磷酸化Rb水平较高，表明Cdkn1a的缺失能够促进细胞周期的进展。此外，转录因子E2F1在GC反应中诱导EZH2。E2f1型-/-小鼠表现出受损的GC反应，这可以通过恢复EZH2表达来挽救，从而定义了一个正反馈回路，其中EZH2-通过抑制CDKN1A来控制GC B细胞增殖，伴随Rb磷酸化和E2F1的释放实现细胞周期进展。组蛋白甲基转移酶EZH2通过产生H3K27me3标记沉默基因。在这里，作者使用3D GC类有机物，并显示EZH2通过CDKN1A的表观遗传沉默和细胞周期检查点的释放介导生发中心（GC）的形成。

PubMed免责声明

利益冲突声明

A.M.M.宣布他是Epizyme的顾问。其余的作者声明没有相互竞争的经济利益。

数字

图1
图1
体内消耗Cdkn1a型救援GC编队鄂尔多斯2 −/−老鼠。鄂尔多斯2 飞行/飞行,Cdkn1a型 −/−,鄂尔多斯2 飞行/飞行;Cγ1-cre和鄂尔多斯2 飞行/飞行;Cγ1-cre；Cdkn1a型 −/−用SRBC免疫同窝小鼠，诱导生发中心（GC）形成，10天后处死。一每组一只代表性小鼠脾脏的流式细胞仪图。选通区域显示GC B细胞的百分比（GL7 + 船边交货+）活B细胞内（B220 + DAPI-，门控策略参见补充图2A）。b流式细胞术测定各组小鼠GC B群平均值一(n个 = 每组7只小鼠）。c（c）福尔马林固定石蜡包埋脾组织进行PNA、Ki67、EZH2和B220染色。图中显示了每组分析的三个脾脏的代表性图片。d日–（f）PNA染色定量c（c）(n个 = 每组3个脾脏）。d日“#GC/脾段”是每个脾段的所有GC计数。e（电子）“GC面积/脾脏总面积”是每个GC的量化面积除以脾脏截面的总面积。（f）“总GC面积/总脾脏面积”是某一节段中所有GC量化面积的总和除以该脾脏节段的总面积。克脾细胞被渗透，并使用荧光染色结合的抗EZH2抗体对GC B和EZH2进行染色。选通区域显示GC B细胞的百分比（GL7 + 船边交货 + ) 活B细胞内（B220 + DAPI-，参见补充图2A了解选通策略），EZH2为正。所示的流程图代表了每组分析的三个脾脏。中的值b,d日,e（电子）,（f）显示为平均值 ± 扫描电镜。t吨测试*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01***P（P） < 0.001. 结果代表了对不同组小鼠进行的总共四项独立实验。另请参见补充图2
图2
图2
Cdkn1a型 −/−GC抢救与EZH2的组蛋白甲基转移酶功能有关。Cdkn1a型 +/+和Cdkn1a型 −/−用SRBC免疫小鼠，每天用GSK503（150 mg/kg/天）或溶媒，免疫后10天处死。一每组一只代表性小鼠脾脏的流式细胞仪图。选通区域显示GC B细胞的百分比（GL7 + 船边交货 + ) 活B细胞内（B220 + DAPI-，选通策略参见补充图2A）。b流式细胞术测定各组小鼠GC B群平均值一(n个 = 每组5只小鼠）。c（c）福尔马林固定石蜡包埋脾组织进行PNA、Ki67、EZH2和B220染色。图中显示了每组分析的三个脾脏的代表性图片。d日–（f）PNA染色定量c（c）(n个 = 每组3个脾，见图1d–f）。克,小时来自4 WT和4 WT的脾细胞Cdkn1a型 −/−对小鼠进行透化并对GC B细胞进行染色（GL7 + 船边交货 + B220型+，门控策略参见补充图2A）和H3K27me3克和EZH2小时分别使用荧光结合抗H3K27me3和抗EZH2抗体。直方图描述了平均荧光强度（MFI） ± 每组小鼠H3K27me3和EZH2的SD。中的值b,d日,e（电子）,（f）显示为平均值 ± 扫描电镜。t吨测试*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01***P（P） < 0.001. 结果代表了对不同组小鼠进行的总共三项独立实验。另请参见补充图3
图3
图3
描述3D B细胞滤泡类有机物以模拟GC反应。一3D B细胞滤泡器官制造方案。脾B细胞与40LB基质细胞和IL4共同封装在RGD呈现的纳米复合水凝胶中，该水凝胶包含与合成硅酸盐纳米颗粒离子交联的明胶。b三维类器官培养中脾脏GFP B细胞的代表性荧光图片。c（c）3D B细胞滤泡类器官的流式细胞术图。顶部的门控区域显示了活动的B电池（B220 + DAPI−）和底图上的类有机GC B细胞（GL7 + 船边交货 + ) 活B细胞内。d日类有机物GC B种群的平均值，如c（c）.e（电子）增殖的有机类GC B种群的平均百分比，如补充图4B所示进行量化。（f）增殖染料的MFIe（电子）.克annexinV染色的GC B细胞流式细胞术图。小时凋亡GC B细胞百分比的平均值量化为克.我培养4天和6天后类器官GC B细胞的RNA-seq谱（类器官GCB d4，n个 = 4个脾和d6，n个 = 将3个脾脏）投射到由免疫小鼠（体内GCB，n个 = 6只小鼠），CD138 + 浆细胞（体内PC，n个 = 6只小鼠）和FAS-GL7-IgD + B220型 + 原始B细胞（NB，n个 = 3只老鼠）。j个,k个GC B细胞基因表达水平的热图显示于我，表示为相对于平均原始B细胞的log2比率j个也就是说浆细胞k个.PC1/2 = 主成分1/2。我对脾细胞进行透化和EZH2染色，并对GL7、FAS、IgD和B220进行共染色，以鉴定GC B细胞（FAS + GL7型 + B220型+）和幼稚B细胞（FAS-GL7-IgD + B220型 + ).米EZH2的MFI(n个 = 每组3个）我.n个,o（o）所示的免疫球蛋白可变位点是从类器官或体内GC B和原始B细胞中测序的(n个 = 每组3个生物重复）。t吨测试与原始B细胞*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01. 中的值d日–（f）,小时,米–o（o）都是卑鄙的 ± 扫描电镜。d日–小时,n个 = 每个时间点3个有机物。结果如所示b–小时是4个独立实验的代表。另请参见补充图4
图4
图4
CDKN1A公司EZH2的阻遏是GC B细胞周期进展所必需的。一–（f）有机物是使用从鄂尔多斯2 飞行/飞行;Cγ1-cre，Cdkn1a型 −/−,鄂尔多斯2 飞行/飞行;Cγ1-cre；Cdkn1a型 −/−和鄂尔多斯2 飞行/飞行对照小鼠(n个 = 每组3只小鼠），培养4天后进行流式细胞仪分析。一每个基因型代表性有机物的流式细胞仪图。门控区显示了类有机GC B细胞（GL7）的百分比 + 船边交货 + ) 活B细胞内（B220 + DAPI−）。b流式细胞术定量的有机类GC B群体平均百分比一(n个 = 每组3个生物重复）。c（c）有机物接收到2的BrdU脉冲 收获前h。用BrdU染色和7AAD分析细胞周期，测定DNA含量。典型的门控区显示了类有机GC B细胞（GL7）的百分比 + 船边交货 + B220型 + DAPI−）处于S相（BrdU + ).d日流式细胞术定量的各组基因型S期类有机GC B群体的平均百分比c（c）(n个 = 每组3个生物重复）。e（电子）对类器官细胞进行渗透并对EZH2和GC标记物GL7、FAS和B220进行染色，以鉴定类器官GC B细胞。流式细胞仪图显示每个基因型组一个代表性样本。（f）类器官GC B细胞中EZH2的MFI(n个 = 3） 通过流式细胞术进行定量，如e（电子）.克–米类器官是使用从3个细胞中分离的B细胞产生的Cdkn1a型 +/+和3Cdkn1a型 −/−老鼠。克EZH2抑制剂GSK343和BrdU体外治疗方案。小时对器官细胞进行渗透处理，并对EZH2、H3K27me3和GC标记GL7、FAS和B220进行染色。流式细胞仪图显示每组一个代表性样本。我用流式细胞术测定类器官GC B细胞中H3K27me3和EZH2的MFI小时(n个 = 每组3个生物重复）。j个–米分析类有机GC B细胞的百分比和S期细胞的百分比，如一–d日(n个 = 每组3个生物重复）。k个,米显示平均值 ± SEM值b,d日,（f）,我都是卑鄙的 ± 标准偏差。t吨测试*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01***P（P） < 0.001. 结果代表了总共三个独立实验
图5
图5
EZH2是在GC B细胞中实现Rb磷酸化所必需的。一图1所示的小鼠福尔马林固定石蜡包埋脾脏组织进行磷酸化Rb Ser780和PNA染色。图中显示了每个基因型组分析的三个脾脏的代表性图片。b,c（c）磷酸化Rb Ser780染色的定量一(n个 = 每组3个脾脏）。b“每个GC面积/总脾面积的pRb阳性”是每个GC的量化面积除以脾切片的总面积。c（c）“总GC面积/总脾脏面积中pRb阳性”是某一节段中所有GC量化面积之和除以该脾脏节段的总面积。值显示为三倍的平均值 ± 扫描电镜。t吨测试**P（P） < 0.01.d日原始B细胞（FAS）全细胞裂解物的免疫印迹−GL7型−免疫球蛋白D+B220型+)和GC B细胞（FAS+GL7型+B220型+)从2中排序Cdkn1a型 −/−, 2鄂尔多斯2 飞行/飞行;Cγ1-cre；Cdkn1a型 −/−双淘汰赛（DKO）和2鄂尔多斯2 飞行/飞行对照小鼠接种SRBC 10天。GAPDH被用作负荷控制。DKO GC B细胞中微弱的EZH2带是由于少数残留的GC B细胞仍为EZH2-阳性，这与CRE介导的不完全切除鄂尔多斯2.左边的数字表示分子量，单位为kDa。western blots的非剪切扫描见图6A
图6
图6
E2F1在GC B细胞中诱导EZH2的表达。一的FPKM中的表达水平E2F（E2F）来自4个人扁桃体的原始B细胞和GC B细胞中的基因。水平黑线表示平均值。t吨测试***P（P） < 0.001.bRT-qPCRE2f（E2f）在GCB（FAS）中 + GL7型 + B220型 + ) 和原始B细胞（FAS-GL7-IgD + B220型 + ) 从7只WT小鼠中进行分类。水平黑线表示标准化的平均折叠变化mRNA水平Hprt1（小时）.t吨测试***P（P） < 0.001.c（c）两份人类扁桃体样本的原始B细胞和GC B细胞的全细胞裂解物的免疫印迹。肌动蛋白被用作负荷控制。所示的western印迹代表了所分析的五个扁桃体。关于蛋白质印迹的非剪切扫描，请参见补充图6B。d日表达针对E2F1、E2F2或对照的shRNAs的OCI-Ly1和OCI-Ly 7细胞的全细胞裂解物的代表性免疫印迹。GAPDH被用作负荷控制。实验又重复了两次，结果相似。参见补充图6C了解蛋白质印迹的非剪切扫描。e（电子）基因启动子对应的基因组区域示意图EZH2型。黑框表示推测的E2F结合位点区域。设计了两对引物侧翼推测E2F结合位点。（f）E2F1和对照IgG qChIP使用中描述的引物在指定的细胞系中进行e（电子）作为阴性对照，使用引物对第6和第7染色体上的两个区域进行qPCR，其中OCI-Ly1和OCI-Ly 7细胞中的ChIP-seq读取密度未发现转录因子富集。作为阳性对照，使用E2F结合位点两侧的引物进行qPCRCDK1型。将折叠富集归一化为输入。数值显示为技术三倍的平均值 ± SEM。所示实验代表了使用OCI-Ly1和OCI-Ly 7执行的三个独立ChIP，以及使用WSU-DLCL2执行的两个ChIP
图7
图7
以EZH2相关方式形成GC需要E2F1。一–（f） E2f1型 −/−对照组WT小鼠接种SRBC诱导GC形成，10天后处死。一B细胞平均百分比（B220 + ) 在每组小鼠的活脾细胞（DAPI-）内(n个 = 每组9个）。b每组一个代表性小鼠脾脏的流式细胞术图。选通区域显示GC B细胞的百分比（GL7 + 船边交货 + ) 活B细胞内（B220 + DAPI−，选通策略参见补充图2A）。c（c）流式细胞术定量的各组GC B人群百分比的平均值b(n个 = 每组9人）。d日福尔马林固定石蜡包埋脾组织进行PNA、Ki67、EZH2、磷酸化Rb Ser780和B220染色。图中显示了每组分析的5个脾脏的代表性图片。e（电子）,（f）PNA染色定量d日(n个 = 每组5个脾脏）。e（电子）“#GC/脾段”是每个脾段的所有GC计数。（f）“GC面积/脾脏总面积”是每个GC的量化面积除以脾脏截面的总面积。结果如所示一–（f）是对不同组小鼠进行的总共三个独立实验的代表。克骨髓移植使用E2f1型 −/−和WT供体小鼠。每个受体组由8只小鼠组成。骨髓。小时用于分析移植小鼠GFP阳性GC B细胞的门控策略。显示GC B细胞（GL7）门控的典型流式细胞仪图 + 船边交货 + ) 活GFP B细胞内（B220 + DAPI-GFP公司 + ) 每个老鼠组。我每个移植组中GFP阳性GC B细胞的平均百分比(n个 = 8） 通过流式细胞术定量，如小时中的值一,c（c）,e（电子）,（f）,我显示为平均值 ± 扫描电镜。t吨测试**P（P） < 0.01***P（P） < 0.001. 结果如所示一–（f）是总共四个独立实验的代表
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