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.2017年10月12日；6（10）：e002641。
doi:10.1161/JAHA.117.006593。

解偶联蛋白2抑制血管损伤临床前动物模型的肌内膜增生

张燕（音译） 1, 张耀磊 2, 魏丽 2, 王培建 3, 芮古 2, 冯亚兴 2, 魏淑杰（Shujie Wei） 1, 柯鹏 1, 张云荣 1, 苏丽南 1, 王强（Qiang Wang） 1, 德利 1, 杨大春 1, 王永德 4, 杨永健 5, 马双涛 5 6
附属公司

解偶联蛋白2抑制血管损伤临床前动物模型的肌内膜增生

张燕（音译）等。 J Am心脏协会. .

摘要

背景：以平滑肌细胞过度增殖和肌内膜增生为特征的冠状动脉支架内再狭窄仍然是一个临床难题。线粒体膜电位与SMC的增殖率有关。本研究旨在筛选一个调节线粒体电位的关键基因，并在临床前动物模型中证实其对肌内膜形成的影响。

方法和结果：我们对结扎与未结扎小鼠颈动脉中差异表达的基因进行转录组筛查。我们观察到解偶联蛋白2基因(Ucp2型)编码UCP2的mRNA在结扎后的前3天短暂上调，然后在第7天到第21天显著下调，在此期间新生内膜显著形成。结扎后第7天UCP2蛋白水平也下降。在结扎的颈动脉中，Ucp2型-/-与野生型同窝小鼠相比，小鼠表现出加速的肌内膜形成，这与超氧物生成增加有关，并且可以通过抗氧化剂4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶氧基（TEMPOL）的处理而减弱。敲除UCP2可增强人主动脉平滑肌细胞的迁移和增殖，TEMPOL也可抑制其增殖，而UCP2过度表达可抑制平滑肌细胞迁移和增殖以及核因子-κB活性的降低。此外，核因子-κB抑制剂减弱了UCP2敲低增强的SMC增殖。腺病毒介导的UCP2过度表达抑制了大鼠和家兔颈动脉球囊损伤后的肌内膜形成以及猪冠状动脉支架内狭窄。此外，UCP2过表达也抑制体外培养的人隐静脉新生内膜增生。

结论：UCP2抑制血管损伤后肌内膜增生，可能是通过抑制核因子-κB依赖的SMC增殖和迁移，使UCP2成为抗再狭窄的潜在治疗靶点。

关键词：新生内膜增生；再狭窄；平滑肌细胞。

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数字

图1
图1
解偶联蛋白2（UCP2）参与肌内膜增生和血管平滑肌细胞（SMC）增殖。A、 转录组阵列的热图，比较结扎和对侧非结扎小鼠颈动脉线粒体功能调节相关基因的表达。n=3。分别用定量实时聚合酶链反应和Western blot检测术后不同时间点未阻断和结扎小鼠颈动脉中UCP2的B和C、mRNA和蛋白表达水平。mRNA的n=5，蛋白质的n=3*P（P）<0.05, **P（P）与对照组相比<0.01。D、 术后3天，未经门控和结扎的小鼠颈动脉中血小板衍生生长因子（PDGF）的蛋白表达。n=3**P（P）<0.01 vs无门控。使用或不使用人重组PDGF治疗24和48小时的人主动脉平滑肌细胞中UCP2的E和F、mRNA和蛋白表达。mRNA的n=6，蛋白质的n=4*P（P）<0.05, **P（P）<0.01 vs对照组（0小时）。G、 用或不用PDGF处理48小时的SMC的JC-1染色。JC‐1单体发出绿色荧光，而J‐聚集体发出橙红色荧光。棒材=50μm。H、 用绿色（低ΔΨm）到红色（高ΔΨ）荧光评估线粒体膜电位（Δψm）。n=6个独立实验**P（P）与对照组相比<0.01。
图2
图2
解偶联蛋白2（UCP2）消融加剧了小鼠颈动脉结扎诱导的肌内膜增生。A、 苏木精和伊红（H&E）染色的颈动脉结扎切片Ucp2型 −/−结扎后第7、14、21和28天，小鼠和野生型（WT）同窝伴侣。棒材=50μm。B、 结扎动脉的内膜/中层比率。n=8*P（P）<0.05, **P（P）<0.01. C、 二氢乙硫铵（DHE）染色的结扎颈动脉冰冻切片Ucp2型 −/−和在饮用水（1 mmol/L）中加入或不加入4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶氧基（TEMPOL）治疗21天的WT小鼠。棒材=50μm。D、 DHE荧光强度的量化。n=6**P（P）<0.01 vs WT‐控制；# P（P）<0.05,## P（P）与未使用TEMPOL的等基因小鼠相比，<0.01。E、 使用或不使用TEMPOL治疗的小鼠颈动脉结扎切片的H&E染色。棒材=50μm。F、 结扎动脉的内膜/中膜比率。每组n=8**P（P）<0.01. G、 使用或不使用TEMPOL治疗的小鼠颈动脉结扎切片中Ki67（棕色）的免疫组织化学染色。棒材=50μm。H、 新生内膜内Ki67阳性细胞的百分比。n=8*P（P）<0.05, **P（P）<0.01.
图3
图3
解偶联蛋白2（UCP2）抑制平滑肌细胞（SMC）增殖和迁移。A、 转染UCP2特异性和对照阴性siRNA的培养人主动脉平滑肌细胞中UCP2的蛋白表达。n=3个独立实验**P（P）与阴性siRNA.B相比<0.01，通过划痕试验评估SMC迁移。将UCP2特异性和阴性siRNA转染的SMC在单层中培养汇合，用无菌200μL移液管尖端刮伤，并用或不用4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶氧基（TEMPOL；1 mmol/L）处理。24小时后拍摄图像。黄色线条勾勒出没有单元格的区域。C、 根据B计算回收面积**P（P）与用相同siRNA转染的对照细胞相比，<0.01；## P（P）与转染UCP2特异性siRNA的血小板衍生生长因子（PDGF）-BB处理细胞相比，<0.01；++ P（P）与转染负siRNA的PDGF‐BB处理细胞相比，差异<0.01。n=6个独立实验。D、 使用比色分析试剂盒（CCK‐8）测量SMC增殖。用或不用TEMPOL处理UCP2特异性和阴性siRNA转染的SMC，并用CCK-8试剂孵育24小时；然后，使用微孔板阅读器读取450nm处的吸光度。n=6个独立实验*P（P）<0.05, **P（P）与转染相同siRNA的对照细胞相比<0.01；## P（P）与转染相同siRNA的PDGF‐BB处理细胞相比，<0.01；++ P（P）与转染负siRNA的PDGF‐BB处理细胞相比，差异<0.01。E，转染表达UCP2和绿色荧光蛋白（GFP；Ad‐UCP2）的腺病毒或单独转染GFP的SMC中UCP2的蛋白表达。n=3**P（P）与Ad‐GFP相比<0.01。F和G，经PDGF-BB处理24小时的Ad-UCP2或Ad-GFP转染SMC的迁移和增殖。n=8**P（P）与Ad‐GFP相比<0.01。
图4
图4
解偶联蛋白2（UCP2）抑制核因子κB（NFκB）。A、 蛋白磷酸化阵列显示了PDGF刺激的人主动脉平滑肌细胞（SMCs）与表达UCP2（Ad‐UCP2）的腺病毒转染的血小板衍生生长因子（PDGF）途径和单独的绿色荧光蛋白（GFP）之间的不同表达谱。B、 转染Ad-UCP2或Ad-GFP的PDGF处理的SMC细胞质和核提取物中NFκB p65的蛋白表达。p65，65千Da；GAPDH，37kDa；H3为18kDa。C、 分别通过GAPDH和H3标准化的细胞质和细胞核p65表达的定量。n=6个独立实验*P（P）<0.05. D、 转染UCP2特异性或阴性siRNA的SMC中p65（红色）的免疫荧光染色。染色前24小时，用或不用PDGF（20 ng/mL）、4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶氧基（TEMPOL；1 mmol/L）和NF-κB抑制剂BAY 11‐7085（10μmol/L）处理细胞。细胞核用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；蓝色）进行复染。E、 NF‐κB p65水平的定量表示为DAPI标准化的免疫荧光强度。n=6个独立实验*P（P）<0.05, **P（P）<0.01. F、 使用ELISA试剂盒测量NF‐κB p65转录活性。将D中处理过的细胞核提取物添加到用NF‐κB反应元件固定的平板中。用一种特异性一级抗体和一种结合辣根过氧化物酶的二级抗体检测p65。添加显影剂后，使用微孔板阅读器读取450 nm处的吸光度。n=6个独立实验**P（P）<0.01. G、 使用CCK‐8测量经PDGF和BAY 11‐7085处理24小时的siRNA转染SMC的增殖。n=4个独立实验。H、 p65（红色）在结扎颈动脉冰冻切片中的免疫荧光染色Ucp2型 −/−和野生型（WT）小鼠。细胞核用DAPI（蓝色）复染。棒材=50μm。
图5
图5
解偶联蛋白2（UCP2）改善球囊损伤引起的肌内膜增生。用球囊损伤Sprague-Dawley大鼠和新西兰兔的颈动脉，并局部感染仅表达绿色荧光蛋白（GFP）的腺病毒（Ad-GFP）或同时表达UCP2和GFP的腺病毒。21天后，取损伤的动脉进行染色。A、 苏木精和伊红染色的颈动脉切片。棒材=200μm。大鼠（B）和兔（C）损伤动脉的内膜/中层比率。n=每组8只动物*P（P）<0.05. D、 平滑肌（SM）α-actin的免疫组织化学染色。棒材=200μm。SMα-actin阳性区域占大鼠（E）和兔（F）损伤动脉新生内膜的百分比。n=6。G、 Ki67的免疫组织化学染色。棒材=200μm。大鼠（H）和兔（I）损伤动脉新生内膜内Ki67阳性细胞的百分比。n=6**P（P）与Ad‐GFP相比<0.01。
图6
图6
解偶联蛋白2（UCP2）抑制小型猪冠状动脉支架内狭窄。A、 贵州小型猪裸金属支架植入3个月后的冠状动脉造影。通过局部药物输注球囊导管，将表达UCP2和绿色荧光蛋白（GFP；Ad‐UCP2）的腺病毒或仅表达GFP（Ad-GFP）的腺病毒转染支架动脉段。红色箭头表示狭窄。B、 支架远端猪冠状动脉的苏木精-伊红（H&E）染色切片。棒材=100μm。C、 支架冠状动脉的H&E染色切片。棒材=500μm。D、 转染Ad-GFP或Ad-UCP2的冠状动脉支架内狭窄。n=5**P（P）<0.01.
图7
图7
解偶联蛋白2（UCP2）抑制人隐静脉新生内膜的发育。A、 在RPMI 1640培养基加血小板衍生生长因子（PDGF；10 ng/mL）中培养的单独表达绿色荧光蛋白（GFP）的腺病毒（Ad‐GFP）和UCP2和GFP（Ad‐UCP2）转染的人隐静脉的苏木精和伊红染色（上图）和Verhoeff–Van Gieson染色（下图）切片。棒材=100μm。B、 培养人大隐静脉的内膜/中层比率。n=6**P（P）<0.01.
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