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.2017年10月12日；8（10）：e3117。
doi:10.1038/cddis.2017.524。

c-Abl介导的Drp1磷酸化促进氧化应激诱导的线粒体断裂和神经元细胞死亡

周路军 1 2, 张强（Qiang Zhang） 1, 张鹏（音译） 1, 孙雷（Lei Sun） 三, 坎鹏 三, 袁增强 4 5, 程金波 4
附属公司

c-Abl介导的Drp1磷酸化促进氧化应激诱导的线粒体断裂和神经元细胞死亡

周路军等。 细胞死亡病. .

摘要

氧化应激诱导的线粒体功能障碍和神经元细胞死亡在神经退行性疾病的发展中起着重要作用。动力蛋白相关蛋白1（Drp1）是调节线粒体动力学的关键因素。已报道Drp1的多种翻译后修饰，包括磷酸化、泛素化、sumoylation和S-亚硝基化。在本研究中，我们发现c-Abl在体内外磷酸化了酪氨酸266、368和449处的Drp1，这增强了Drp1的GTPase活性并促进了Drp1-介导的线粒体断裂。一直以来，c-Abl介导的磷酸化对Drp1的GTPase活性和线粒体断裂很重要。此外，我们发现c-Abl介导的Drp1磷酸化是初级皮层神经元氧化应激诱导细胞死亡所必需的。总之，我们的研究结果表明，c-Abl-Drp1信号通路调节氧化应激诱导的线粒体断裂和细胞死亡，这可能是神经退行性疾病治疗的潜在靶点。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
c-Abl参与线粒体形态的调控体内。(一)用生理盐水或MPTP（四次腹腔注射20 2时为mg/kg h间隔）。在2 完全注射后h，按照材料和方法部分所述进行免疫电镜检查。为每组选取两个代表性图像（上部和下部）。箭头表示SN中含有线粒体的酪氨酸羟化酶阳性区域。比例尺，0.5 μ米(b条)测量线粒体长度，并将其分为<0.5、0.5–0.7、0.7–1.0、1.0–1.5和>1.5的不同类别 μm.线粒体长度的量化显示为总线粒体的百分比（每个小鼠至少测量50个线粒体）。（双向方差分析*P（P）与WT组相比<0.05#P（P）与WT+MPTP组相比<0.05，n个=3只小鼠。）。(c（c）)纹状体组织或(d日)收集WT和c-Abl KO同窝小鼠的腹侧中脑2 在用盐水或MPTP处理后h，并使用所指示的抗体进行免疫印迹。(e（电子）)0.5后用抗Tom20抗体对初级皮质神经元进行免疫染色 μ0、0.5、1和2的M DPH处理 h、 然后是共焦显微镜。比例尺，10 μ米(如果)面板线粒体形态定量(e（电子）). （双向方差分析，分段：****P（P）<0.0001，与0相比 h组；n个=3张幻灯片）。(克)0.5处理的初级皮层神经元的裂解物 μ用指定的抗体对指定时间的M DPH进行免疫印迹
图2
图2
c-Abl与Drp1相互作用并磷酸化。(一)左面板：100天后用抗Drp1和抗c-Abl抗体对初级皮质神经元进行免疫染色 μ月H2O（运行）2是否治疗0.5 h、 然后是共焦显微镜。右侧面板：皮尔逊相关系数（学生t吨-测试***P（P）<0.001,n个=4). (b条)含有或不含有100个初级皮层神经元的裂解液 μ月H2O（运行）2处理0.5 用抗Drp1抗体免疫沉淀h，然后用抗c-Abl抗体免疫印迹。(c（c）)转染表达质粒Myc-c-Abl和GFP-Drp1的HEK-293T细胞的裂解物 毫米高2O（运行）2处理0.5 用抗GFP抗体免疫沉淀h，并用抗Myc抗体进行免疫印迹。(d日)左面板：c-Abl激酶受到在体外以重组全长His-sumo-Drp1（rDrp1）为底物，添加或不添加10 μM STI571治疗。用抗磷酸酪氨酸抗体免疫印迹分析磷酸化。右面板：对-Tyr-Drp1的标准化水平。（学生的t吨-测试***P（P）<0.001,n个=3). (e（电子）)来自用Flag-Drp1和Myc-c-Abl-WT或Myc-c-Abl-KD（激酶死亡）表达质粒转染的HEK 293T细胞的裂解物用抗Flag抗体免疫沉淀，然后用抗磷酸酪氨酸抗体免疫印迹
图3
图3
c-Abl激活促进内源性Drp1的酪氨酸磷酸化。(一)含有1的SH-SY5Y细胞的裂解液 毫米高2O（运行）2用GFP抗体免疫沉淀指定时间的治疗，并用指定抗体进行免疫印迹。(b条)含有1的SH-SY5Y细胞的裂解液 毫米高2O（运行）2治疗1 h、 与STI571处理一起或不与STI571处理一起用GFP抗体进行免疫沉淀并用所指示的抗体进行免疫印迹。(c（c）和d日)按照图1a中的相同方法处理小鼠。腹侧中脑(c（c）)和纹状体组织(d日)收集并使用抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫沉淀，然后用所示抗体进行免疫印迹
图4
图4
c-Abl在Y266、Y368和Y449磷酸化Drp1。(一)对图2d中的磷酸化反应进行SDS-PAGE，然后进行考马斯蓝染色。从凝胶中切下对应于Drp1的带，并用胰蛋白酶消化。通过微柱液相色谱-MS/MS对磷酸化位点进行了定位，Drp1氨基酸序列的覆盖率为92.8%。鉴定出三个磷酸化酪氨酸位点。(b条)Drp1蛋白中三个磷酸化位点的示意图。(c（c）)用抗Flag抗体免疫沉淀转染Flag-Drp1 WT或其他Drp1突变体的HEK 293T细胞的裂解物和Myc-c-Abl WT表达质粒，并用抗磷酸酪氨酸抗体免疫印迹分析。(d日)转染HEK 293T细胞的Flag-Drp1 WT、Y226F和3YF突变体的免疫沉淀物在体外用c-Abl激酶进行激酶测定。用抗磷酸酪氨酸抗体免疫印迹法分析磷酸化反应
图5
图5
c-Abl介导的Drp1磷酸化增加了Drp1的GTPase活性。(一)左图：用所示抗体免疫印迹转染Flag-Drp1（含或不含Myc-c-Abl）的HEK 293T细胞的细胞溶质和线粒体部分的裂解物。中间面板：细胞溶质部分中Drp1的标准化水平。（学生的t吨-测试，P（P）=0.2,n个=3). 右面板：线粒体部分Drp1的标准化水平。（学生的t吨-测试***P（P）<0.001,n个=3). (b条)左图：用所示抗体对转染Flag-Drp1 WT和其他突变体的HEK 293T细胞的细胞溶质和线粒体部分的裂解物进行免疫印迹。右面板：线粒体部分Drp1的标准化水平。（单向方差分析，P（P）>0.05,n个=3). (c（c）)用转染载体或c-Abl或PKA的HEK 293T中的免疫沉淀Drp1 WT或K38A进行GTPase分析。Drp1 K38A组和PKA组分别作为阴性和阳性对照（单因素方差分析**P（P）<0.01, ****P（P）<0.0001,n个=3). (d日)在HEK 293T中用或不用c-Abl转染的免疫沉淀的Drp1 WT或突变体进行GTPase测定。（单向方差分析****P（P）<0.0001,n个=3). (e（电子）)SH-SY5Y细胞未经处理或用200 μ月H2O（运行）2用于4 h、 有或没有5 μM STI571型。然后对免疫沉淀的Drp1进行GTPase分析。（单因素方差分析**P（P）<0.01,n个=3). NS，不显著
图6
图6
c-Abl介导的Drp1磷酸化与线粒体断裂有关。(一)用抗Drp1或GAPDH抗体对感染Drp1敲除慢病毒的SH-SY5Y细胞裂解液进行免疫印迹。(b条)用抗GFP或β-微管蛋白抗体。(c（c）)用所示质粒转染并用100 μ月H2O（运行）2用于3 h用抗Tom20抗体和DNA染料DAPI进行免疫染色，然后用共焦显微镜观察。比例尺，10 μ米(d日)在三个不同的载玻片上评估80至120个细胞的线粒体形态。（双向方差分析，分段：****P（P）<0.0001，与shRNA载体+pEGFP载体组相比；####P（P）<0.0001，与shDrp1+GFP-Drp1 WT-R组相比，n个=3张幻灯片）
图7
图7
c-Abl介导的Drp1磷酸化促进神经元细胞死亡。(一)将pEGFP单独或与Myc-c-Abl表达质粒、Drp1 RNAi（shDrp1 2#）或对照载体一起转染DIV4皮层神经元。72小时后，将神经元固定并用Hoechst 33258染色，计算细胞死亡数。凋亡细胞用黄色箭头表示，存活细胞用白色箭头表示。比例尺，50 μ米(b条)面板的统计分析(一)（单向方差分析****P（P）<0.0001,n个=3). (c（c）)将pEGFP和Drp1 RNAi或对照载体单独或与Drp1 WT-R、Y266F-R和3YF-R表达质粒一起转染DIV4皮层神经元。72小时后，对神经元进行50-80次治疗 μ月H2O（运行）2用于12 h，用Hoechst 33258染色进行细胞死亡分析。（单因素方差分析*P（P）<0.05, ***P（P）<0.001,n个=3)
图8
图8
氧化应激通过c-Abl-Drp1信号调节神经细胞死亡的工作模型。在该模型中，活化的c-Abl诱导Drp1酪氨酸磷酸化，从而增强其GTPase水解活性，并促进Drp1介导的线粒体断裂以应对氧化应激。线粒体断裂参与细胞凋亡的启动，最终导致神经细胞死亡
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