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.2017年9月27日：9:308。
doi:10.3389/fnagi.2017.00308。 2017年电子收集。

DJ-1通过调节伴侣介导的自噬抑制α-突触核蛋白聚集

徐传英 1, 文彦康 1, 陈一萌 2, 天房江 1, 张佳 1, 李娜·张 三, 建清鼎 1, 刘军（Jun Liu） 1, 陈盛迪 1 2
附属公司

DJ-1通过调节伴侣介导的自噬抑制α-突触核蛋白聚集

徐传英等。 前部衰老神经科学. .

摘要

α-突触核蛋白错误折叠和聚集在帕金森病（PD）的发病机制中起着重要作用。PARK7/DJ-1基因功能丧失和突变导致早发家族性PD。DJ-1可以抑制α-突触核蛋白的聚集，并可能在聚集过程的早期发挥作用。可溶性野生型（WT）α-突触核蛋白主要通过伴侣介导的自噬（CMA）降解，而CMA的损伤与PD的发病机制密切相关。用DJ-1敲除小鼠和DJ-1 siRNA敲除SH-SY5Y细胞研究DJ-1缺陷与α-突触核蛋白聚集之间关系的潜在机制。首先，我们证实DJ-1缺乏增加了SH-SY5Y细胞和PD动物模型中α-突触核蛋白的积累和聚集，以及DJ-1的过度表达在体外有效降低α-synuclein水平。α-突触核蛋白过表达通过提高溶酶体相关膜蛋白2A（LAMP2A）的水平激活CMA，但DJ-1缺陷抑制了LAMP3A的上调。DJ-1缺乏下调了溶酶体70kDa热休克同源蛋白（HSC70）的水平，但不下调匀浆中的水平。进一步研究表明，DJ-1缺陷加速了溶酶体中LAMP2A的降解，导致α-突触核蛋白的聚集。我们的研究表明，DJ-1缺陷通过抑制CMA的激活，加剧了α-突触核蛋白的聚集，并进一步证明了PD-相关蛋白之间通过CMA途径的分子相互作用。

关键词：DJ-1；LAMP2A；帕金森病；伴侣介导的自噬；α-突触核蛋白。

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数字

图1
图1
DJ-1抑制SH-SY5Y细胞中α-突触核蛋白的积累。（A–C）DJ-1缺乏加重了SH-SY5Y细胞中α-突触核蛋白的积累。将野生型（WT）α-synuclein质粒和DJ-1 siRNA共同转染到SH-SY5Y细胞中48小时。所示蛋白质的免疫印迹如所示（A），α-突触核蛋白和DJ-1水平变化的量化如所示（B、C）分别为（平均值±SEM，n个= 3, ***第页<0.001 vs.α-synuclein载体控制，###第页<0.001 vs.加扰控制）。（D–F）WT DJ-1过度表达抑制SH-SY5Y细胞中α-突触核蛋白的积累。将WTα-synuclein质粒和WT DJ-1质粒共同转染到SH-SY5Y细胞中48小时。所示蛋白的免疫印迹如所示（D），α-突触核蛋白和DJ-1水平变化的量化如所示（E、F）分别为（平均值±SEM，n个= 6, ***第页<0.001 vs.α-synuclein载体控制，###第页<0.001 vs.DJ-1矢量控制）。
图2
图2
DJ-1抑制帕金森病（PD）动物模型中α-突触核蛋白的积累和聚集。（A–H）与DJ-1+/+小鼠相比，在SDS-可溶性和脲-可溶性组分中甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）给药后，DJ-1缺陷会加速DJ-1−/-小鼠腹侧中脑样品中α-突触核蛋白的积累和聚集。α-突触核蛋白的免疫印迹如所示（A）对于TBS-soluble，（C）对于TX-100固液，（E）对于SDS-可溶性和（G）对于尿素可溶部分。此外，α-突触核蛋白水平变化的量化如（B、D,F、 H）（平均值±SEM，n个＝3*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001与盐水对照；#第页与DJ-1+/+相比<0.05）。
图3
图3
SH-SY5Y细胞中内源性α-突触核蛋白在溶酶体中通过伴侣介导的自噬（CMA）降解。（A，B）NH处理SH-SY5Y细胞后测定内源性α-突触核蛋白水平4Cl作用9.5小时。所示蛋白质的免疫印迹如所示（A）α-synuclein水平的定量如所示(B类; 平均值±SEM，n个= 3, **第页与对照组相比<0.01）。（C–H）分别用二磷酸氯喹（CQ）、3-甲基腺嘌呤（3-MA）和乳酸菌素处理24小时后，测定SH-SY5Y细胞内源性α-突触核蛋白的水平（C）,E、 G），α-突触核蛋白水平的定量如所示（D）,F类,H）分别为（平均值±SEM，n个= 3, **第页与对照组相比<0.01）。（I–K）测定了溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）敲低SH-SY5Y细胞中内源性α-突触核蛋白的水平。所示蛋白质的免疫印迹如所示（一），α-突触核蛋白和LAMP2A水平的定量如所示（J、K）分别为（平均值±SEM，n个= 3, ***第页<0.001与对照组，###第页<0.001 vs.加扰）。（L–N）在LAMP1敲低的SH-SY5Y细胞中测定内源性α-突触核蛋白水平。所示蛋白质的免疫印迹如所示（左），α-突触核蛋白和LAMP1水平的定量如所示（男，女）分别为（平均值±SEM，n个= 3, ***第页<0.001与对照组，###第页<0.001 vs.加扰）。
图4
图4
DJ-1缺乏对SH-SY5Y细胞CMA和α-突触核蛋白水平的影响。（A–D）在与WTα-突触核蛋白质粒和DJ-1 siRNA共转染的SH-SY5Y细胞的匀浆中测定LAMP2A、HSC70、LAMP1、α-突触核蛋白和DJ-1的水平（A），LAMP2A、HSC70和LAMP-1水平的量化如所示（B–D）分别为（平均值±SEM，n个= 3, 3, 4, **第页与矢量控制相比<0.01，##第页<0.01 vs.加扰）。（东-西）测定WTα-synuclein质粒和DJ-1 siRNA共转染SH-SY5Y细胞的溶酶体富集组分中LAMP2A、HSC70和LAMP-1的水平。所示蛋白质的免疫印迹如所示（E、G），LAMP2A和HSC70水平的量化如所示（F、H）分别为（平均值±SEM，n个= 4, *第页<0.001与矢量控制，##第页<0.01 vs.加扰）。
图5
图5
DJ-1缺陷SH-SY5Y细胞溶酶体中LAMP2A降解加速。（A）实时PCR分析WTα-synuclein质粒和DJ-1 siRNA共转染SH-SY5Y细胞48h后LAMP2A mRNA的水平（平均值±SEM，n个= 3,#第页<0.05与扰频，##第页<0.01 vs.加扰）。（B、C）在DJ-1缺陷细胞中，LAMP2A的降解加快。将SH-SY5Y细胞与WTα-synuclein质粒和DJ-1 siRNA共转染或打乱48 h，然后与环己酰亚胺（CHX；50μg/ml）孵育指定时间。所示蛋白质的免疫印迹如所示（B）LAMP2A水平的量化如所示(C类; 平均值±SEM，n个= 4, *第页<0.05与扰频**第页<0.01 vs.加扰***第页<0.001 vs.加扰）。（D–G）在用NH处理的SH-SY5Y细胞中测定内源性LAMP2A的水平4Cl、CQ和乳酸菌素24小时。所示蛋白质的免疫印迹如所示（D、F、H），LAMP2A水平的量化如所示（E、G、I）分别为（平均值±SEM，n个＝3*第页与对照组相比<0.05**第页与对照组相比<0.01***第页与对照组相比<0.001）。
图6
图6
提出了DJ-1通过调节CMA抑制α-突触核蛋白积累和聚集的工作模型。在正常条件下，WT a-synulicien是CMA的底物，而DJ-1缺陷加速了LAMP2A的降解，并损害了CMA的活性，导致α-synuclein积累。
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