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.2017年10月10日10:6:e29595。
doi:10.7554/eLife.29595。

生物工程血管中的载脂蛋白E和循环高密度脂蛋白促进β淀粉样蛋白的清除

杰罗姆·罗伯特 1 2, 艾米丽·巴顿 1 2, 布莱恩·袁 1 2, 梅根·吉尔穆尔 1 2, 凯文·康 1 2, 阿文·巴赫拉巴迪 1 2, 苏菲·斯图卡斯 1 2, 赵文成 1 2, 伊瓦·库利奇 1 2, 谢丽尔·惠灵顿 1 2
附属机构

生物工程血管中的载脂蛋白E和循环高密度脂蛋白促进β淀粉样蛋白的清除

杰罗姆·罗伯特等。 埃利夫. .

摘要

淀粉样斑块由沉积的β-淀粉样蛋白（Aβ）组成，是阿尔茨海默病（AD）的神经病理学特征。脑血管在AD中起主要作用，因为aβ通过涉及脑血管系统的途径从大脑中清除，大多数AD患者患有脑血管淀粉样变（脑淀粉样血管病，CAA），心血管危险因素增加痴呆风险。在这里，我们通过在生物工程人体血管中生成第一个CAA功能三维模型，展示了血管组织工程的显著进展。我们发现，包括脑（apoE）和循环（高密度脂蛋白，HDL）在内的脂蛋白协同促进Aβ在生物工程人脑血管中的转运。这些脂蛋白促进Aβ42转运的效率高于Aβ40，这与Aβ40是CAA中积累的主要物种一致。此外，在促进Aβ转运方面，载脂蛋白E4不如载脂蛋白E2有效，这也与载脂蛋白E在AD中Aβ沉积中的既定作用相一致。

关键词：阿尔茨海默病；脑血管；人；人类生物学；脂蛋白；药物；神经科学；组织工程。

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利益冲突声明

没有宣布竞争利益。

数字

图1。
图1.生物工程血管的示意图。
脚手架材料被制备成管状，直径约为2 mm，长度约为15 mm(一). 支架依次接种原代人脐静脉平滑肌细胞（SMC，橙色）和内皮细胞（EC，黄色）以形成二分血管，或添加原代人星形胶质细胞（Ast，蓝色）以形成三分血管(b条). 在含有组织室的生物反应器中培养生物工程血管约4-6周(c（c）)在管腔前一侧提供血管外介质，以及包含内皮介质的循环回路，内皮介质在搏动条件下使用蠕动泵流过血管腔。
图2。
图2二分体生物工程血管的组织结构。
(一)血红素和曙红染色显示由细胞和细胞外基质（ECM）组成的致密组织形成。(b条)苦味酸染色证实胶原分泌。针对层粘连蛋白的进一步免疫染色(c（c）)和IV型胶原蛋白(d日)确认细胞分泌ECM。α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达(e（电子）)证实了内层细胞的平滑肌表型和CD31阳性染色(（f）)证实生物工程血管管腔侧存在内皮细胞单层。使用Evans蓝外渗测定法证实了功能性内皮屏障(g、 小时). 比例尺代表200μm(a–f)或1毫米(g、 小时)，L：流明。
图2——图补充1。
图2补充图1。Aβ40和Aβ42在接种来源于脐带或皮层的细胞的组织中的积累类似。
将Aβ40和Aβ42单体（1μM）注射到接种有来自脐带或脑动脉的SMC的组织的组织腔（前腔）中，并在流动条件下培养24小时，然后用ELISA测量生物工程血管内的Aβ沉积(a–b). 将Aβ40和Aβ42单体（1μM）注射到接种有HUVEC或皮层微血管EC（hCMEC）的组织的组织腔中。通过ELISA测定在指定时间超过4小时时从腔循环介质中采集的样品中转运的Aβ水平(c–d码). 图表表示至少四个独立组织的平均值±SEM。
图3。
图3 Aβ40和Aβ42在二分血管内积聚并通过二分血管运输。
将Aβ40和Aβ42单体（0、0.1、1.0和10μM）注入组织腔（前腔），并在流动条件下培养48小时(a–f). 使用ELISA测量生物工程血管内的β沉积(a–b)，用抗Aβ抗体6E10 Aβ进行免疫染色(d–e日)和硫黄素S染色(e、 （f）). 为了确定CAA形成的动力学，将Aβ40和Aβ42单体（1μM）注射到组织室中，并孵育指定的时间，然后通过ELISA测量Aβ组织浓度(g、 小时)或使用硫黄素T在组织内聚集(i、 j个). 将Aβ40和Aβ42单体（1μM）注入管腔前腔，并在指定时间从循环（管腔）腔中取样介质后，测量Aβ转运(k、 我). 图表表示至少四个独立组织的平均值±SEM**p=0.01和***p=0.001。条形代表50μm，L：流明。
图3——图补充1。
图3补充1。沉积在生物工程血管中的Aβ的组织结构。
(一)OC纤维和α-SMA的共聚焦免疫染色证实了纤维化的Aβ40和Aβ42沉积在细胞外。(b条)针对6E10和Col-IV的共聚焦免疫染色证实了Aβ40和Aβ42在细胞外基质中的沉积以及细胞内的囊泡（白色箭头）定位。棒材代表200μm。
图4。
图4：脂蛋白减少生物工程二分血管内Aβ42的蓄积。
将Aβ40和Aβ42单体（1μM）在37°C下无重组载脂蛋白E（比例25:1）或与重组载脂酶E（比例25∶1）孵育2小时，然后注入管腔前组织腔。通过ELISA测定在指定时间超过4小时时从腔循环介质中采集的样品中转运的Aβ水平(a–b)，以及Aβ注射后24小时收集的血管组织(c–d码). 将Aβ40和Aβ42单体（1μM）注入管腔前腔，在没有或存在200μg/ml管腔循环HDL的情况下(e–f)和血管组织(克–小时)如上所述进行测量。图表表示至少四个独立组织的平均值±SEM*p=0.05，**p=0.01和**p=0.001。
图5。
图5：在重组apoE存在的情况下，HDL促进Aβ42的转运并减少生物工程二分血管中的蓄积。
Aβ40和Aβ42单体（1μM）在不含或含重组apoE2的情况下培养(a–d)或apoE4(e–h)（比率25:1）在37°C下注射2小时，然后在没有或存在200μg/ml循环HDL的情况下将其注射到组织腔中，并评估输送的HDL(a–b、e–f))并积累(c–d、g–h)ELISA检测。图5a–b、e–f所示的Aβ和Aβ+HDL转运数据表示特定apoE2和apoE4实验产生的数据，这些数据在图4e–f中被提取、汇总和绘制，以表示总转运数据。图表表示至少四个独立组织的平均值±SEM。*，§和#p=0.05，##和**p=0.01，***p=0.001。
图6。
图6三部分生物工程血管的组织结构。
CD31的免疫染色证实在三支血管管腔侧存在EC单层(一)α-SMA的表达证实了内层细胞的平滑肌表型(b条)GFAP的表达证实了管腔前层存在星形胶质细胞(c（c）)生物工程三部分血管。(d日)特定GFAP阳性区域的高倍图像显示星形胶质细胞终足样结构。使用紧密连接蛋白ZO-1的免疫染色进一步分析EC屏障(e（电子）)、ZO-2(（f）)和克劳丁5(克)以及BBB-特异性葡萄糖转运蛋白（谷氨酸）-1(小时). 埃文斯蓝染色证实内皮细胞紧密(我). 在缺乏或存在1 mM eNOS抑制剂L-NAME的情况下，通过测量乙酰胆碱（Ach）或HDL刺激后NO的分泌来确认EC功能(j个). 通过用1μM LXR激动剂GW3965处理组织72小时并测量分泌到培养基中的星形胶质细胞衍生apoE水平，确认星形胶质细胞功能(k个). 条形图代表200μm(a–h)或1毫米(我)，L：管腔和图表表示至少四个独立组织的平均值±SEM*p=0.05，**p=0.01和**p=0.001。
图6——图补充1。
图6补充图1。生物工程组织中的星形胶质细胞表达水通道蛋白4和NDRG2。
用水通道蛋白4（AQ4）免疫染色法进一步分析三部分组织中的星形胶质细胞(一)或NDRG2(b条)带有星形细胞标记物（GFAP，S100β）。棒材代表50μm。
图6——图补充2。
图6补充图2。在生物工程血管中培养时，HUVEC表达大脑谷氨酸-1转运体。
将EC生物工程组织与人脑和脐带进行比较，进一步进行谷氨酸-1和EC标记物CD31免疫染色分析。棒材代表200μm。
图6-图补充3。
图6-图补充3.生物工程血管的内皮对FITC-葡聚糖是不可渗透的。
通过测量250μg/ml的4 kDa或40 kDa FITC-右旋糖酐在腔中循环1小时的渗透性来评估屏障完整性。图表表示至少三个独立组织的平均值±SEM****p=0.0001。
图7。
图7高密度脂蛋白促进Aβ转运并减少表达天然星形胶质细胞apoE的生物工程三分血管中的蓄积。
(a–d)用LXR激动剂GW3965（0.8μM）处理三股血管72小时，以刺激星形胶质细胞apoE3分泌。将Aβ40和Aβ42单体（1μM）注入组织腔，在没有或存在200μg/ml循环HDL的情况下，加入或不加入GW3965。通过ELISA测定在指定时间超过4小时时从腔循环介质中采集的样品中转运的Aβ水平(a–b)和Aβ注射24小时后收集的血管组织(c–d码). 通过Western blotting定量生物工程组织中的ApoE蛋白水平(e（电子）)带有代表性斑点。Aβ转运(f–g)和组织堆积(h–i)如上所述，在二分和三分生物工程血管之间直接进行比较。图表表示至少四个独立组织的平均值±SEM*p=0.05，**p=0.01和**p=0.001。
图8。
图8淀粉样纤维的运输速度较慢，但在二分组织和三分组织之间的积累类似。
(a–d)将预聚集或单体Aβ40和Aβ42（1μM）注射到组织腔内。通过ELISA测定在指定时间超过4小时时从腔循环介质中采集的样品中转运的Aβ水平(a–b)和Aβ注射24小时后收集的血管组织(c–d码). Aβ组织蓄积(e–f)直接比较了上述两部分和三部分生物工程血管。图表表示至少四个独立组织的平均值±SEM*p=0.05，**p=0.01和**p=0.001。
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中的注释

  • 建立更好的血脑屏障。
    Lane-Donovan C，Herz J。 Lane Donovan C等人。 埃利夫。2017年10月10日；6:e31808。doi:10.7554/eLife.31808。 埃利夫。2017 采购管理信息：28994392 免费PMC文章。

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