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.2017年11月15日；130(22):3862-3877.
doi:10.1242/jcs.211656。 Epub 2017年10月5日。

肠类有机物中核运动间迁移和基底栓系促进有丝分裂后子代分离

托马斯·D·卡罗尔 1, 阿利斯泰尔·兰兰兹 1, 詹姆斯·奥斯本 2, 伊恩·P·牛顿 1, 保罗·L·阿普尔顿 三, Inke Näthke墨水 4
附属公司

肠类有机物中核运动间迁移和基底栓系促进有丝分裂后子代分离

托马斯·D·卡罗尔等。 细胞科学杂志. .

摘要

更新组织的稳态需要平衡的增殖、分化和运动。这在肠上皮中尤其重要，因为谱系追踪表明，随机分化选择与细胞相对于生态位的位置密切相关。为了确定位置是如何实现的，我们追踪了肠类器官中的增殖细胞，发现有丝分裂姐妹的行为预示着长期位置。我们发现，正常情况下，70%的姐妹仍然是邻居，而30%的姐妹在胞质分裂后失去联系和分离。这些有丝分裂后的位置预测了姐妹们所处位置的长期差异：随着时间的推移，相邻姐妹达到了相似的位置；在一对分离的姐妹中，一个保持在其出生地附近，而另一个则向上迁移。计算模拟隐窝动力学证实，有丝分裂后的分离导致姐妹到达不同的隔室。我们发现，核的运动间迁移、细胞大小和从细胞基底侧延伸的过程中的不对称栓系都有助于分离。这些过程在大肠腺瘤性息肉病中发生改变(亚太区)失去分离的突变上皮。我们的结论是，有丝分裂后的位置有助于随机生态位退出，当缺陷时，支持克隆扩展亚太区突变细胞。

关键词：大肠腺瘤性息肉病；核动力相互迁移；肠上皮；有丝分裂。

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利益冲突声明

竞争利益作者声明没有竞争利益或财务利益。

数字

图1。
图1。
H2B–GFP有丝分裂动力学-表达 肠类有机物。（A） 肠道类器官有丝分裂阶段的共聚焦切片。类器官用Hoechst 33342、鬼笔肽和γ-微管蛋白染色（另见图S1). 重点介绍了基本过程（BP）。24天后野生型H2B–GFP表达肠类有机物的典型亮场（B）和荧光（C）图像 强力霉素治疗h。指出了类器官的隐窝和绒毛结构域的位置。（D） 有丝分裂细胞及其子细胞的人工追踪。轨迹是基于时间的彩色编码（红色方框），并覆盖在相邻单元格的轨迹上（绿色），自动跟踪。在本例中，轨迹表示覆盖66的延时 最小。显示了隐窝（用黑色虚线勾勒）和绒毛域的位置。（E） 肠类器官有丝分裂动力学。B中突出显示的有丝分裂细胞切片（2D）。显示了前期（白色）、中期（紫色）、胞质分裂（红色）和子细胞核（蓝色和红色）。心尖表面的估计位置由虚线表示。（F） 有丝分裂之前、期间和之后的细胞速度，测量母体（灰线）和子体（红/蓝线）的细胞速度。通过跟踪器官中心随时间的变化（黑线）来测量整个器官的运动，以供参考。计算了来自三种不同器官的60个有丝分裂细胞的平均速度。数据显示为平均值±标准偏差。突出显示了包括INM、胞质分裂、基底细胞运动（BM）和间期在内的时间点。
图2。
图2。
子细胞的细胞分裂后分离。手动追踪有丝分裂细胞60个 胞质分裂前min，子代再进行120次 分为两种有丝分裂类型：（A）相邻的子细胞或（B）有丝分裂后分离的子细胞。显示的是通过器官分支的3D投影（顶部面板）和2D截面。中期（绿色）和子期（红色/蓝色）以及心尖表面的大致位置（红色圆圈）。代表性轨迹显示有丝分裂母细胞（黑线）和子细胞（红/蓝线）与原始起始位置的距离。显示前期（P）、中期（M）、胞质分裂（C）、INM和基底细胞运动（BM）。相邻子体之间的距离（灰色虚线）≤1核宽（6 μm）而分离子体之间的距离更大。（C） 有丝分裂后分离事件的相邻细胞核（紫色）、母核（青色）和子核（红色/蓝色）的3D呈现。显示了包括INM、胞质分裂和分离后（120 胞质分裂后min）。（D） 女儿分居体内地窖底部女儿的代表性图像。样品用Hoechst 33342（蓝色）和指骨苷（红色）染色。突出显示的是在2D和3D视图（左侧面板）中显示的两个准女儿（白色星星）。虚线表示地下室底部的轮廓。表面渲染（右侧面板）高亮显示细胞-细胞边界和相邻的细胞核。染色质的外观以及细胞之间的相互接近和位置与突出显示的细胞一致，这些细胞代表晚期有丝分裂，产生两个子细胞。（E） 在胞质分裂后的指定时间（=时间0），沿着连接姐妹核中心（红色和蓝色星号）的线创建H2B–GFP线密度曲线。显示参考图像（3D投影）。请注意x个-表示距离的轴在右侧面板中进行更改，以适应分隔子对象之间增加的空间。（F） 用Mitotracker染色的H2B–GFP类有机物的单个框架突出显示有丝分裂细胞，其子代在有丝分裂后不久分离（灰色球体）。图中显示了反映中期、胞质分裂和子代回到间期位置（再插入）的时间点。在胞质分裂期间和“插入”之后，标记子代（A和B）之间产生了线密度曲线。重新插入后，检测到一个离散的H2B–GFP峰，该峰对应于取代两个子细胞的相邻细胞（红色箭头）。相邻细胞的H2B–GFP信号两侧有两个明显的Mitotracker峰（黑色箭头）。
图3。
图3。
亚太区突变体后代分离的频率较低。（A） 野生型和野生型小睾丸隐窝产生的固定类器官的3D投影亚太区最小值/+用Hoechst 33342（蓝色）、阴茎肽（红色）和γ-微管蛋白（绿色）染色的小鼠。亚太区最小值/+LOH形成囊肿的细胞中的有机物(亚太区最小值/最小值). 隐窝和vilus域的位置标记为一个分支（另请参阅图S3). （B） 有丝分裂子代的安置类型在器官样体（野生型）中进行评分n个=6491个有丝分裂；亚太区最小值/+,n个=3227个有丝分裂；亚太区最小值/最小值,n个=7，34个有丝分裂）。每种有丝分裂类型的相对频率按类器官确定，并对复制类器官取平均值****P（P）野生型之间相邻和分离子代的数量<0.0001，亚太区最小值/+和亚太区最小值/最小值类有机物(t吨-测试）。（C） 有丝分裂细胞的位置是相对于野生型和亚太区最小值/+类有机物。测量沿隐窝绒毛轴的每种有丝分裂类型的频率(n个=3). 干细胞（SC）和转运扩增（TA）区室由Lgr5–GFP阳性细胞的平均位置标记（见图S5). 数据显示为平均值±s.e.m.（D）核速度是以野生型和亚太区最小值/+类有机物(n个=3个有机物，20个细胞）。数据显示为INM、基底细胞运动和间期的平均±s.e.m.速度****P（P）野生型和亚太区最小值/+类有机物；ns，不显著(t吨-测试）。
图4。
图4。
有丝分裂后的分离促进了生态位的保留和退出。（A） 典型的图像显示了子细胞在单独或相邻放置后的长期行为示例。子体轨迹的叠加（子体1，红色；子体2，蓝色）显示了随时间推移的总位移（白色箭头）。（B） 将子细胞重新插入上皮细胞（～2 h） 并在能够记录的最终位置（5–35 h） 。计算每对子代的位移（每个子代随时间从地穴底部的移动）。女儿1被定义为离地穴底部最近的女儿。计算分离（分离，n个=28）或相邻（一起，n=84）姐妹。***P（P）<0.001; ns，不显著(t吨-测试）。（C） 模拟结果：代表性图像显示，子体最初相邻放置（红色），并以一个细胞直径分开放置（蓝色）。所示的快照表示有丝分裂后的这些情况，12 h后（右侧面板）。（D） 模拟结果显示了细胞分离随出生时间的分布。结果显示了同质群体（i）的细胞分裂，其中子细胞彼此相邻放置（即。S公司=1光盘对于所有分裂），以及对于异质群体（ii）的细胞分裂，其中S公司=1光盘三分之二的分区（红色）和S公司=2光盘s代表剩余的三分之一（蓝色）。显示平均间距（实线）和标准偏差（阴影区域）。线性拟合分布（5-15 h） 用虚线表示。CD，试管直径。（E） 初始单元布置对分离速度影响的模拟结果。每一次分离都会产生一个异质的分裂群体（三分之二的分裂群体S公司=1，三分之一S公司≠1），计算相应的分离（如D所示），并记录值的分布。分离速度是通过将线性拟合的梯度取为两个分区（红色相邻，蓝色分隔）的分布平均值来计算的。最初分开放置的细胞比放在一起的细胞分离得更快。（F） 与E的数据相同，但除法仅限于水平面，因此删除了z（z）方向。当没有z（z）对于分馏分离，分馏对分离速度没有影响。（G） D中所示模拟的细胞分裂在不同小生境中产生细胞的比例的模拟结果（即一个细胞留在增殖室，而另一个细胞离开）。结果显示了同质群体（i）的细胞分裂，其中所有子细胞彼此相邻放置（即。S公司=1（所有分裂）和异质群体（ii）的细胞分裂，其中S公司=1表示三分之二的除法（红色）和S公司=剩余三分之一（蓝色）为2。这些分布的常数拟合（使用所有年龄段的数据）用虚线表示。（H） 模拟结果显示了具有不同位置的细胞对的平均比例（使用来自F的常数拟合）如何取决于初始分离。与E中使用的模拟相同。增加分离导致不同位置的细胞对比例更大。（一） 与H的数据相同，但除法仅限于水平面，因此删除了z（z）方向。当没有z（z）对于分裂分离组分，分裂分离对不同生态位的细胞比例没有影响。（J） 分离细胞接管地穴的概率。从指定的分离细胞比例开始，我们运行模拟，直到所有细胞“相邻”或“分离”；注意，这里的除法分离是一个继承的属性（而不是像在所有其他模拟中那样是随机的）。红线表示与相邻单元格相同的分离单元格，而蓝线表示分离单元格在分裂时相隔四倍的结果。这表明分离是有利的。
图5。
图5。
有丝分裂细胞的基底栓系在亚太区突变上皮。（A） 类器官和整个组织中有丝分裂细胞的3D投影揭示了基本过程（箭头）。样品用Hoechst 33342（蓝色）、阴茎倍体蛋白（红色）、γ-微管蛋白（绿色）和β4-整合素（白色）染色。显示了基本过程的示意图。（B） 中期排列的有丝分裂细胞的3D投影，显示其基底突起（箭头）、中心体（绿色）、细胞核（蓝色）和有丝分裂平面的位置。对称或非对称过程遗传根据其相对于每个中心体的位置进行评分。因此，基底突起可以定位于靠近地穴基部（“底部”）的细胞，距离每个中心体（“中部”）等距离，或距离地穴基最远（“顶部”）。在显示的2D剖面图中，视图的方向是，每个图像中的地下室底部朝向底部。（C） 在3D中，通过目视检查基底突起相对于有丝分裂细胞的位置，对突起遗传进行评分。图中显示了两个有丝分裂细胞的例子，一个是不对称的，另一个是对称的突起位置（另请参阅图S3). 3D表面渲染显示了基础过程的位置。（D） 通过测量基础突起的附着点与野生型干细胞（SC）和跨扩增（TA）室中每个预期子代中心体之间的距离，对突起分离进行评分(n个=12类有机物，n个=68个有丝分裂）和亚太区最小值/+(n个=20类有机物，n个=61个有丝分裂）类有机物。频率显示为每个器官和每个隔室中每个结果的平均百分比。干细胞室中不对称定位的基底突起数量显著减少亚太区最小值/+类有机物与野生类有机物干细胞室中的类有机物进行比较。人工评分，如果明显偏离卵裂沟，则定义为不对称。为了确认手动评分，计算了所有评分的不对称和对称过程的过程位移。位移被定义为从过程到每个中心体的距离之差（右侧面板）。数据显示为平均值±标准偏差。不对称有丝分裂的过程位移显著高于对称有丝分裂***P（P）<0.001; ****P（P）<0.0001; ns，不显著(t吨-测试）。（E） 延时电影的个别画面显示一个女儿（红色）反复尝试占据母亲的原始位置（绿色），而另一个女儿则继续移动（蓝色）。（F）用SiR-Actin染色的H2B-GFP类有机物的个别画面，显示其子代经历有丝分裂后分离的细胞。显示包括中期（0）的时间点 分钟），胞质分裂（9-12 min）和重新插入时的两个女儿（18-27 min），当它们被邻居隔开时（黑色星号）。不对称过程（白色/红色箭头）位于假定卵裂沟一侧靠近子代1的位置。顶面用粗虚线表示。
图6。
图6。
亚太区突变通过阻止核运动间迁移和缩小细胞大小限制子代的分离能力。（A） 野生型中期代表性图像，亚太区最小值/+和亚太区最小值/最小值用Hoechst 33342（蓝色）和指骨苷（红色）染色的肠类器官。红色箭头指向基本过程。（B） 在野生型中测量间期细胞的顶基距离，亚太区最小值/+和亚太区最小值/最小值图像中的有机物（左侧面板）。野生型和亚太区最小值/最小值类有机物。在分离的野生型中测量细胞大小，亚太区最小值/+和亚太区最小值/最小值流式细胞术检测细胞。测定每个基因型的正向散射中位数并求平均值。数据为平均值±标准误差(n个=3），并相对于野生型单元格的大小显示****P（P）野生型和亚太区最小值/最小值类有机物(t吨-测试）。（C） H2B–GFP类器官电影中显示INM的单个帧。对于每个基因型，在前期、INM和胞质分裂期间都有代表性的有丝分裂。显示了通过器官样分支或囊肿的3D（最大强度投影）和横向（2D）视图。隐藏域在上部面板中以虚线表示。顶部表面的估计位置由下部面板中的虚线圆圈显示。中间和底部面板中的白色箭头指向一个有丝分裂细胞无法进行INM的例子。（D） 野生型细胞有丝分裂过程中INM的动态，亚太区最小值/+和亚太区最小值/最小值相对于起始距离测量(n个=每个基因型10个细胞）。数据显示为平均值±标准偏差。母亲（黑线）和女儿（红线和蓝线）的测量值重叠（另请参见图S5). （E） 用Hoechst 33342（蓝色）和鬼笔素（红色）染色的人FAP结肠组织的振动切片。显示三维投影（顶部面板）和剖面视图（底部面板）。突出显示的是“正常外观”和“发育异常”区域。突出显示的区域（虚线）显示了一个带有细胞堆积/伪标记的地窖。（F） 面板E中FAP结肠组织的“正常”和“异常增生”区域的隐窝放大图。基底和顶端表面以白色虚线突出显示。白箭头突出显示了进行核运动间迁移的细胞。比例尺：10 微米。（G） FAP组织中“正常”和“异常增生”区域隐窝中三个细胞的细胞形态。显示了单个细胞的F-actin和细胞核的表面呈现。比例尺：5 微米。（H） FAP组织中有丝分裂细胞错位的例子。白色箭头指向假定的中期细胞，这些细胞异常地位于距顶端表面相当远的地方。
图7。
图7。
生态位保留时间延长的模型亚太区突变细胞出现。在未转化的肠上皮中，维持正常的组织结构。在有丝分裂期间，细胞经历INM，其特征是细胞核在细胞向上变圆时顶端移动。这使得子细胞保持在近端，或者被相邻细胞相互取代。置换促进细胞在其出生地的保留，并允许另一个细胞退出生态位。INM和基底过程的不对称分离促进了这种位移。一个突变后亚太区等位基因(亚太区最小值/+)，有丝分裂偏向邻近位置，迁移较慢，有利于生态位保留。杂合性缺失时(亚太区最小值/最小值)，由于细胞尺寸减小和INM抑制，所有细胞失去分离能力。因此，可以促进囊肿的对称生长，促进组织结构的改变。
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