跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2017年11月16日；45（20）：11725-11742。
doi:10.1093/nar/gkx782。

核有丝分裂器蛋白NuMA以p53依赖性的方式控制rDNA转录并调节核仁应激反应

斯瓦希·贾亚拉曼 1 2, Shirisha Chittiboyina公司 1, 白云峰 1, 帕特里夏·C·阿巴德 1, 皮尔雷·阿莱克安德烈·维迪 1, 辛西娅·斯陶法赫 2 三, Sophie A Lelièvre（索菲A Lelièvre） 1 三
附属公司

核有丝分裂器蛋白NuMA以p53依赖性的方式控制rDNA转录并调节核仁应激反应

斯瓦希·贾亚拉曼等。 核酸研究. .

摘要

核有丝分裂器蛋白NuMA参与主要的细胞事件，如DNA损伤反应、凋亡和p53介导的生长抑制，所有这些都在应激时受到核仁的控制。蛋白质组学研究已在数百种核仁蛋白中鉴定出NuMA。然而，NuMA和核仁功能之间的确切联系仍不确定。我们确认NuMA存在于核仁中，并揭示了NuMA在放线菌素D或阿霉素诱导的核仁应激中的重新分布。NuMA与RNA聚合酶I、核糖体蛋白RPL26和RPL24以及与rDNA转录相关的ATP依赖性染色质重塑复合物B-WICH的组分共免疫沉淀。NuMA还与18S和28S rRNA结合并定位于rDNA启动子区域。NuMA表达下调会触发核仁应激，如新生前rRNA合成减少、纤维蛋白核周帽形成和p27kip1上调，但p53无此表现。与生理相关的核仁应激诱导与活性氧物种重申了p53依赖的p27kip1反应途径，并导致新生的前rRNA减少。它还促进了NuMA数量的减少。NuMA在rDNA转录和p53诱导的依赖性核仁应激反应中的这种先前未经特征化的功能支持了这种核结构蛋白在细胞内稳态中的中心作用。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
NuMA存在于乳腺上皮细胞的核仁中。(A类)T4–2细胞总蛋白提取物（total）和纯化核仁组分（nucleoli）中NuMA、核糖体相关蛋白纤维蛋白和RPL26、细胞质标记物α-管蛋白和核质53BP1的免疫印迹。(B类). 用非特异性免疫球蛋白（对照）或NuMA抗体（NuMA）孵育的生长抑制S1细胞（第10天）的电子显微照片显示了NuMA的定位（插图中的箭头指示了一些金颗粒[黑点]）。图中显示了不同的核仁亚室。(C类)根据电子显微照片中FC和DFC/GC区域每面积测量的NuMA金粒子数，量化NuMA金免疫标记粒子在核仁FC和DFC/GC区域内的分布。散点图上的误差条表示标准偏差。共有八个核仁[面积从～0.15到1μm不等2]用每个核含有一个核仁的四个核、每个核含有两个核仁的三个核和含有三个核仁的一个核进行分析；FC，纤维中心；DFC，致密纤维中心；GC，颗粒中心。
图2。
图2。
放线菌素D抑制rDNA转录影响NuMA的分布。在37°C下，用载体（DMSO）或0.08μg/ml放线菌素D（Act D）处理4小时，或用载体（DMSO/PBS）或0.3μM阿霉素（Dox）处理6小时，生长停滞的S1细胞（10天培养），并对纤维菌素、NuMA和PML进行免疫染色。DNA用DAPI染色。(A类和C类)表明放线菌素D（A）或阿霉素（C）处理后形成了核周帽（箭头）和/或核仁内环（箭头）。比例尺：5μm。(B类和D类)纤维素酶和NuMA核仁内和/或核仁周堆积百分比条形图**P（P）<0.01***P（P）< 0.001; 未成对学生的t吨-测试。[每个重复得分的细胞核总数：>300，n个= 3; 注：Dox的三个技术副本]。
图3。
图3。
NuMA与核糖体生物发生的蛋白质和核酸成分相互作用。S1细胞在完全培养基中培养8天，然后在没有EGF的情况下培养2天，以诱导增殖停滞；T4–2细胞培养6天。(A类)用NuMA抗体（NuMA）或非特异性免疫球蛋白（IgG）对S1和T4-2细胞的核提取物进行免疫沉淀（IP），然后使用NuMA和NM1抗体对输入和免疫沉淀样品进行蛋白质印迹分析。(B类)S1细胞核提取物的免疫沉淀，然后进行NuMA和RNA聚合酶I（RNA pol I）的western blot分析。(C类)带有NuMA抗体的T4–2细胞的ChIP(n个=4）或RNA聚合酶I抗体(n个=2），然后RT-qPCR用于rDNA的编码（pro-1，H4，H8，H13）和非编码（H18）区域。图中显示了rDNA基因的组织结构（IGS=基因间序列）。将数据归一化为通过IgG控制获得的数据（参见“材料和方法”一节）。(D类)用NuMA抗体或核提取物和可溶性提取物的非特异性IgG从T4–2细胞中进行RNA免疫沉淀（后者用50μg/ml环己酰亚胺[CH]处理）。用人18S和28S rRNA特异性引物对DNA酶处理的非逆转录RNA（nonRT RNA）和DNA酶处理后的逆转录cDNA（cDNA）样品进行PCR(n个= 2). (E类和F类)S1细胞核提取物的免疫沉淀，然后对NuMA、RPL26和RPL24进行western blot分析。
图4。
图4。
沉默NuMA可降低rRNA水平，对与核糖体生物发生或p53依赖性核仁应激反应相关的蛋白质无显著影响。用NuMA的siRNA（siNuMA）或非靶向序列（siNT）转染S1细胞，并在培养中保留至第8天。(A类)定量RT-PCR检测45S前rRNA、相关18S RNA和28S RNA。显示了小干扰RNA处理后NuMA表达下降的典型western blot。拉明B用作加载控制。(B类)FUrd标记siNuMA处理细胞中的新生rRNA。通过NuMA、聚合酶I[Pol I]和FUrd的三重免疫染色进行分析。Pol I在核仁中的独特位置（步骤1）用于确认DAPI染色细胞核上较弱的区域确实是核仁（步骤2）。在DAPI图像上描绘核仁区域后，将该区域用于相应的FUrd染色细胞核（步骤3），以执行“材料和方法”部分中所示的分析。核质中无免疫染色显示NuMA沉默的细胞（见带箭头的细胞核表示Pol I染色；仍显示NuMA染色的细胞核包括一个箭头表示PolⅠ染色）。条形图显示了在具有（+）或不具有（−）NuMA表达的细胞的核仁中FUrd染色的相对强度。对每种治疗条件下的30多个细胞进行分析(n个= 3). (C类)通过western blot分析对经siNuMA处理的细胞中相对于经siNT处理的细胞水平的蛋白质进行定量。所示为典型的western blot图像。拉明B用作加载控制。尺寸棒，10μm*P（P）< 0.05, ***P（P）< 0,001; 一个样品t吨-测试。
图5。
图5。
沉默NuMA并用ROS治疗可导致p53依赖性核仁应激反应。S1细胞用抗NuMA（siNuMA）或非靶向siRNA（siNT）处理，并在培养10天，和/或在第10天用0.08μg/ml放线菌素D（Act D）或对照DMSO处理4小时，和/或者用250μM的h2O（运行）2第10天持续4小时。(A类)NuMA免疫染色（红色），细胞核DAPI染色（蓝色）。图中还显示了NuMA的代表性western印迹；层粘连蛋白B用作负载控制。(B类)纤维蛋白染色为红色的细胞核的代表性图像。注意它们在“对照”（−）培养物中的核仁分布。箭头表示在所有治疗中纤维蛋白的核周帽形成。细胞核用DAPI（蓝色）染色。条形图显示了具有纤维蛋白核周帽的细胞百分比，表明核仁应力(n个= 3; 每种情况分析150个核）。(C类)p27的蛋白质印迹基普1，遵循D或H法案2O（运行）2在有（siNuMA）或无（siNT）siRNA对抗NuMA的情况下进行治疗；层粘连蛋白B用作负荷控制。图表显示第27页基普1针对层粘连蛋白B标准化后不同条件下相对于siNT对照的水平(n个= 3). (D类)通过western blot分析对用siNT或siNuMA处理的细胞中与E中相同复制品和相对于siNT的p53表达进行量化后的条形图；(n个= 3); 所示为典型的western-blot图像。(E类)p53和层粘连蛋白B的代表性蛋白印迹用作Act D或H处理细胞的负荷控制2O（运行）2条形图显示p53量化(n个= 3). (F类)在不同处理条件下，将新生rRNA（核仁）的FUrd染色水平标准化为核质染色强度（新生mRNA）(n个= 3; 每种情况分析100个核）*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001; 一个样品t吨-检验[A，D，E]和多因素方差分析Tukey的事后检验[B，C，F]；笔记：对于C和F，用一个样本与图表上标准化的第一个siNT进行单独比较t吨-测试。尺寸棒，50μm。
图6。
图6。
沉默NuMA和放线菌素D和H治疗2O（运行）2通向p27基普1增加，除非已经升高。用抗NuMA的siRNA（siNuMA）或非靶向siRNA（siNT）处理MCF10A WT-p53细胞和p53完整MDA-MB-157细胞，并在第10天（或第8天）培养10天（MCF10A）或8天（MDA-MB157），和/或用0.08μg/ml放线菌素D（Act D）或对照DMSO培养4小时，和/或者用250μM的h2O（运行）2在第10天（或第8天）持续4小时。(A类和C类). 具有表明核仁应力的纤维蛋白核周帽的细胞百分比(n个= 3; MCF10A（A）和MDA-MB-157（C）人群中每种情况分析150个核。(B类和D类). 不同处理条件下核质染色强度（新生mRNA）正常化后新生rRNA（核仁）的FUrd染色水平(n个= 3; 每种情况分析100个核）。所示为经siNuMA处理的MCF10A细胞（B）和MDA-MB-157细胞（D）中NuMA表达的典型western blot。(E类和F类). p27蛋白的Western blot和伴随定量（用层粘连蛋白B进行标准化并与每个Western印迹的第一条带进行比较）基普1，遵循D或H法案2O（运行）2在存在（siNuMA）或不存在（siNT）针对NuMA的siRNA的情况下进行处理；层粘连蛋白B被用作MCF10A（E）和MDA-MB-157（F）细胞的负荷控制。(G公司). p53，NuMA，p27蛋白印迹基普1在未经处理的S1、MCF10A和MDA-MB-157细胞中加载控制层粘连蛋白B。
图7。
图7。
放线菌素D和H治疗2O（运行）2减少NuMA表达。S1细胞用抗NuMA的siRNA（siNuMA）或非靶向siRNA（siNT）处理，并在培养10天后与250μM的H孵育2O（运行）2或在第10天使用0.08μg/ml放线菌素D（Act.D）4小时。(A类). NuMA免疫染色（红色）；细胞核在H后用DAPI（蓝色）染色2O（运行）2治疗。条形图显示了所有处理条件下NuMA染色的细胞百分比(n个= 3; 每种情况分析150个核）。(B类)western blots后NuMA定量条形图和所有治疗条件下负荷对照层粘连蛋白B的标准化。(C类)用250μM的H在3D培养物中处理分化为腺泡的S1细胞后，NuMA、氧化应激反应标记物AOP2和负载对照层粘连蛋白B的代表性蛋白质印迹2O（运行）2持续4小时（Cl=车辆控制）*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; 多因素方差分析和Tukey的事后检验；笔记：对于B，使用一个样本对图中标准化的第一个siNT进行单独比较t吨-测试。尺寸棒，100μm。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Abad P.C.、Lewis J.、Mian I.S.、Knowles D.W.、Sturgis J.，Badve S.、Xie J.、Lelièvre S.A.。NuMA影响人类乳腺上皮的高级染色质组织。分子生物学。单元格。2007; 18:348–361.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Zeng C.，He D.，Brinkley B.R.。哺乳动物细胞核基质中NuMA蛋白亚型的定位。细胞模型。细胞骨架。1994; 29:167–176.-公共医学
    1. Lydersen B.K.，Pettijohn D.E.。与有丝分裂器极区相关的人类特异性核蛋白：在人类/仓鼠杂交细胞中的分布。单元格。1980; 22:489–499.-公共医学
    1. Du Q.，Taylor L.，Compton D.A.，Macara I.G.LGN阻止NuMA结合和稳定微管的能力。一种有丝分裂纺锤体组装调控机制。货币。生物杂志，2002年；12:1928–1933.-公共医学
    1. Fant X.、Merdes A.、Haren L.。纺锤极和NuMA的细胞和分子生物学。细胞国际评论。2004; 238:1–57.-公共医学

MeSH术语