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.2017年11月30日；91（24）：e01532-17。
doi:10.1128/JVI.01532-17。 2017年12月15日印刷。

卡波西肉瘤相关疱疹病毒潜伏相关核抗原全长等位基因在溶血性复制周期细胞的细胞质中积累

雅克·加里格斯 1, 凯利·霍华德 1, 谢尔盖·巴西 1, Ikoma美奈子 1, 阿什利五世摩西 2, 盖尔·H·多伊奇 3, David Wu（吴大卫） 4, 上田庆二 5, 蒂莫西·M·罗斯 6 7
附属公司

卡波西肉瘤相关疱疹病毒潜伏相关核抗原全长等位基因在溶血性复制周期细胞的细胞质中积累

雅克·加里格斯等。 J维罗尔. .

摘要

卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）的潜伏相关核抗原（LANA）具有建立和维持KSHV潜伏期的多种功能。在潜伏期内，LANA定位于细胞核中的离散点状点，将病毒外显子与细胞染色质相连，并与核成分相互作用以调节细胞和病毒基因的表达。通过使用高度敏感的酪胺信号放大，我们确定LANA定位于不同细胞类型的细胞质中，这些细胞经历了复制的裂解周期从头开始原发感染和自发的、十四烷基佛波醇醋酸盐或开放阅读框50（ORF50）/复制反式激活因子（RTA）诱导的激活后。我们证实了在溶血性多中心卡斯特曼病病变的细胞亚群中存在细胞质LANA。通过刮伤融合细胞培养物、在亚融合条件下培养或在原代培养物中诱导细胞分化来诱导细胞迁移，从而上调了原代溶血性KSHV感染所允许的细胞数量。诱导裂解复制的特点是细胞质LANA和核ORF59的高表达，ORF59是裂解复制的标记。亚细胞分馏研究表明，ORF50/RTA激活的Vero细胞原发感染后，细胞质中存在多种LANA亚型。质谱分析表明，细胞质LANA亚型全长，含有N末端核定位信号。这些结果表明，LANA向不同亚细胞位置的贩运是一种受调控的现象，它允许LANA在KSHV生命周期的潜伏和复制阶段与不同隔室中的细胞成分相互作用。重要性卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）可导致AIDS相关的恶性肿瘤，包括淋巴瘤和卡波西肉瘤。KSHV使用其潜伏相关核抗原（LANA）建立终身感染。潜伏期内，LANA定位于细胞核，在那里连接病毒和细胞DNA复合体并调节基因表达，从而使病毒保持长期感染。我们的研究表明，完整的LANA通过细胞质进入经历容许性溶血感染的细胞和诱导病毒复制的潜伏感染细胞。这表明，在KSHV生命周期的不同阶段，LANA在细胞的细胞质和核室中发挥着重要作用。确定LANA细胞核定位的细胞质功能和调节机制将增强我们对该病毒生物学的理解，从而找到消除感染和阻断其病理作用的治疗方法。

关键词：KSHV；LANA；激活；细胞质；质谱；迁移；病毒复制。

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数字

图1
图1
KS和MCD病变中核和细胞质LANA的差异定位。制备石蜡包埋组织切片，用抗LANA单克隆抗体LN53免疫组化检测KSHV LANA蛋白。（A） KS病变。箭头所示为核内点状LANA染色的纺锤状肿瘤细胞。（B） 蒙太奇不同细胞从两个MCD病变。箭头表示细胞核内有点状LANA染色的小细胞，类似于KS病变。箭头表示较大的细胞，LANA定位于细胞核和细胞质。比例尺，20μm。
图2
图2
KSHV感染的原代HOK和Vero细胞培养中核和细胞质LANA的差异定位。（A） 原代HOK培养物用高钙（0.15 mM）诱导分化24小时，（B）Vero猴肾上皮细胞培养物感染KSHV。24 hpi时，细胞培养物固定，并使用带有TSA增强的LN53抗体对LANA（绿色）进行染色。用TO-PRO-3（蓝色）标记细胞核。箭头表示细胞具有点状核LANA荧光，箭头表示细胞质中具有弥漫LANA荧光的细胞。比例尺，20μm。
图3
图3
迁移Vero细胞中核质LANA的差异定位。（A和B）在16mm“斑点”培养基中培养的Vero细胞感染KSHV。24 hpi时，培养物固定并染色LANA（绿色）和细胞核（蓝色）。（A） 现场文化的稀疏边缘，用白线点缀。箭头表示细胞质中弥漫LANA荧光的细胞位于细胞培养物的边缘，细胞在此处扩展到平板的开放区域。箭头表示细胞核中具有点状LANA荧光的相邻细胞。（B） 汇合点培养中心。箭头表示具有点状核LANA荧光的细胞示例。（C） 融合的Vero细胞培养物被刮伤，以刺激细胞迁移和增殖。经过24小时的迁移期，培养物被KSHV感染。在24hpi时，如上所述对培养物进行固定和染色。白线标志着创伤后融合培养物的边缘，代表细胞迁移的起点。箭头表示迁移区的细胞在细胞质中具有弥漫的LANA荧光（标记为细胞核中的黄色圆点）。相邻细胞和汇合区的细胞在细胞核中具有点状的LANA荧光。（D） 具有细胞质LANA的细胞相对于伤口边缘的位置显示为没有蓝色和绿色通道。比例尺：A和B，20μm；C和D，100μm。
图4
图4
原发性KSHV感染后，细胞质LANA与裂解周期标记物ORF59相关。（A至C）将亚流Vero细胞培养物感染KSHV并固定在24 hpi。如材料和方法中所述，使用TSA增强剂，用小鼠抗ORF59（红色）和大鼠抗LANA（LN53）（绿色）依次对细胞进行染色。细胞核用TO-PRO-3（蓝色）染色。（A） ORF59、LANA和TO-PRO-3荧光叠加（红色、绿色和蓝色通道）。箭头指向具有细胞质LANA的细胞。所有具有细胞质LANA的细胞也表达核ORF59。（B） 面板A中的ORF59荧光（仅红色通道）。（C） 高分辨率图像显示核ORF59和细胞质LANA荧光。（D和E）合流Vero培养物被刮伤，伤口边缘的细胞迁移到开放空间24小时。细胞培养物被KSHV感染24小时，固定，并按上述顺序染色ORF59和LANA。（D） ORF59、LANA和TO-PRO-3荧光叠加（红色、绿色和蓝色通道）。箭头指向细胞核ORF59和细胞质LANA荧光位于细胞迁移区的细胞。（E） ORF59和TO-PRO-3荧光叠加（红色和蓝色通道）。箭头指向具有核ORF59荧光的细胞。图中显示了汇合区和细胞迁移区的界线。比例尺：A和B，20μm；C和D，50μm。
图5
图5
潜在KSHV感染重新激活后，细胞质LANA与ORF59表达相关。（A） 携带长期潜伏KSHV感染的BCBL-1细胞用TPA（20 ng/ml）处理48小时以重新激活KSHV。如图4所示，固定细胞并对其进行ORF59、LANA和细胞核的顺序染色。显示具有核ORF59和细胞质LANA荧光（箭头）或点状核LANA荧光的细胞（箭头）。（B） a组BCBL-1细胞与细胞质LANA（绿色-Ch3）和核ORF59（红色-Ch2）的荧光染色图谱，以及DNA的TO-PRO-3染色（蓝色-Ch1）。比例尺，20μm。（C） 用KSHV感染HPV永生化DMVEC细胞并培养35天。将细胞固定并按顺序进行ORF59（绿色）和LANA（橙色）染色。ORF59和LANA荧光叠加在相控图像上。带有核ORF59（大箭头，绿色）的细胞也表达细胞质LANA（小箭头，橙色）。点状LANA和ORF59荧光共同定位在该细胞的细胞核中（黄色）。在缺乏ORF59荧光的细胞中单独观察到Puctate LANA荧光（箭头）。
图6
图6
分化的牙龈上皮细胞初次感染后，细胞质LANA与ORF59的表达相关。（A） 使用高钙（0.15mM）诱导原代HOK培养物分化24小时。用to-PRO-3（蓝色）标记细胞核。细胞边界用虚线表示，以区分大直径细胞（40至70μm），此前已证明这些细胞表达角质形成细胞分化标记物（标有星号）（87）和显示未分化表型的小细胞（15至25μm）（未标记）。（B和C）分化HOK培养物感染KSHV，在24 hpi时，固定培养物并对ORF59、LANA和细胞核进行顺序染色，如图4所示。面板B显示了xy公司投影。箭头表示细胞质中具有弥漫LANA荧光（绿色），细胞核中具有ORF59荧光（红色）的细胞。箭头表示细胞核中具有点状LANA荧光的细胞缺乏ORF59荧光。面板C是一个x赫兹投影显示同时具有ORF59和细胞质LANA荧光的细胞已迁移到显示点状核LANA荧光细胞的基底层。比例尺，20μm。
图7
图7
KSHV感染的Vero细胞中ORF50 RTA的过度表达诱导细胞质LANA和ORF59的表达。用KSHV感染Vero细胞24 h，然后模拟感染（A和B）或重叠感染表达KSHV ORF50 RTA的BacK50重组杆状病毒（6 h），以激活KSHV复制（C和D）；然后将细胞再培养24小时。将细胞固定并按顺序染色以检测ORF59、LANA和细胞核，如图4所示。面板A和C显示TO-PRO-3（蓝色）和ORF59（红色）荧光；面板B和D显示TO-PRO-3（蓝色）和LANA（绿色）荧光，ORF59阳性核呈红色球体。箭头表示细胞具有细胞质LANA荧光，而没有ORF59荧光。（E） 定量表达细胞质LANA和核ORF59的细胞群（分析的细胞数量=375[KSHV]和339[KSHV+BacK50]）。比例尺，50μm。
图8
图8
ORF50 RTA或丁酸钠不能诱导潜在感染KSHV的AGS.219胃上皮细胞胞浆LANA或ORF59的表达。潜伏感染重组KSHV.219的AGS.219细胞系未经处理（A到C）或用丁酸钠（D到F）或BacK50（G到I）激活6小时。细胞再培养24小时，固定，并用LANA（A、D和G）、ORF59（B、E和h）或ORF50（C、F和I）抗体孵育，其次是TSA增强。在未经处理的（A）细胞和活化的（D和G）细胞中均检测到高水平的点状核LANA，但未观察到细胞质LANA。在未经处理的培养物（分别为B和C）或丁酸活化的培养物中（分别为E和F）未检测到ORF59或ORF50荧光。BacK50处理的培养物显示ORF50荧光（I），但没有ORF59荧光（H）。比例尺，20μm。
图9
图9
细胞质LANA对温和的洗涤剂提取敏感。如图7所示，Vero细胞感染KSHV，并通过BacK50的双重感染诱导其进行溶血复制，然后要么不治疗（A到C），要么用0.1%NP-40（D到F）短暂处理，或者用蛋白质提取物组分I提取缓冲液（G到I）溶解细胞质蛋白。固定细胞，并按顺序染色LANA、ORF59和细胞核，如图4所示。在未经处理的培养物（A到C）中，箭头表示许多细胞中的一个细胞具有细胞质LANA（A）和核ORF59荧光（B），合并在面板C中。箭头表示多个细胞中的其中一个具有点状核LANA（A）和无ORF59萤光（B）。用0.1%NP-40或组分I缓冲液提取后，箭头指示许多细胞中的一个，其中细胞质LANA被去除（D和G），但核ORF59和LANA仍然存在（E和H；合并在面板F和I中）。箭头表示具有点状核LANA（D和G）或无核ORF59（E和H）的细胞。比例尺，50μm。
图10
图10
从经BacK50处理的KSHV感染的Vero细胞的胞浆部分分离出具有高相对分子质量和低相对分子质量迁移的LANA亚型。经历原发性KSHV感染（24 hpi）（a至C）的Vero细胞和经历长期潜伏感染（D）的嘌呤霉素选择的AGS.219细胞被BacK50重叠感染，如图7所示。ProteoExtract分馏系统用于从受感染细胞的胞浆（第一道）、膜/细胞器（第二道）、细胞核（第三道）和细胞骨架（第四道）中纯化亚细胞组分。如材料和方法所述，通过Western blotting筛选这些组分的LANA亚型（A和D）和核层粘连蛋白β1（C）。点表示在诱导Vero细胞（A）的胞浆组分I和潜在AGS.219细胞（D）的核和细胞骨架组分III和IV中，多种LANA亚型的相对分子质量从118到230-kDa不等。星号表示诱导Vero细胞（C）的核和细胞骨架组分III和IV中的核层粘连蛋白β1亚型。（B） 在LANA亲和柱上进一步纯化感染Vero细胞胞浆组分I中的蛋白质，用于质谱分析，并通过Western blotting筛选LANA亚型。M、 分子质量标准。
图11
图11
在BacK50诱导KSHV感染的Vero细胞的细胞溶质部分鉴定出含有N末端NLS基序的全长LANA亚型。（A） 通过SDS-gel电泳分离来自BacK50诱导的KSHV感染的Vero细胞（图10B）胞浆组分I的LANA亲和纯化蛋白，并通过质谱分别分析含有不同LANA亚型的凝胶区域1和2。（B） BCBL-1 LANA结构（1117 aa）的示意图显示了包含主要二部分NLS（58）的N末端结构域和由不同重复基序的大区域分隔的C末端结构域。凝胶区域1和2中通过质谱鉴定的胰蛋白酶肽被标记为A-U，并映射到结构上。肽衍生物用素数标记（′），修饰后的肽用上标字母表示（m，甲基化；p，磷酸化）。在多光谱分析中确定的肽谱匹配数显示在每个肽下面。在“edd”、“deqq”和“eqel”重复区中未检测到肽，这些重复区缺乏明显的胰蛋白酶裂解位点。（C） 与KSHV的BCBL-1菌株中的ORF73 LANA序列匹配的肽的位置和序列（NCBI登录号：。ADQ57959)显示了用于感染的修饰氨基酸的位置。指示频谱呼叫的置信水平（H，高；M，中；L，低）。
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