Loss of calponin h1 confers anoikis resistance and tumor progression in the development of high-grade serous carcinoma originating from the fallopian tube epithelium

doi:10.18632/oncotarget.18024

.2017年5月19日；8(37):61133-61145.

doi:10.18632/目标18024。 eCollection 2017年9月22日。

在起源于输卵管上皮的高级别浆液性癌的发展过程中，calponin h1的缺失导致失巢抵抗和肿瘤进展

王凯洪^1 2, 宋朝初^三, 汤元初^1 2 4

附属公司

¹台湾花莲佛教慈济总医院妇科癌症预防中心研究部。
²台湾花莲慈济大学医学院。
^三台湾花莲佛教慈济总医院血液肿瘤科。
⁴台湾花莲佛教慈济总医院妇产科。

PMID： 28977852
预防性维修识别码： PMC5617412
内政部： 10.18632/目标18024

钙调蛋白h1的缺失在源于输卵管上皮的高级别浆液性癌的发展中赋予失巢细胞抗性和肿瘤进展

王凯洪等。 Oncotarget公司. 2017.

.2017年5月19日；8(37):61133-61145.

doi:10.18632/目标18024。 eCollection 2017年9月22日。

作者

王启雄^1 2, 宋朝初^三, 汤元初^1 2 4

附属公司

¹台湾花莲佛教慈济总医院妇科癌症预防中心研究科。
²台湾花莲慈济大学医学院。
^三台湾花莲佛教慈济总医院血液肿瘤科。
⁴台湾花莲佛教慈济总医院妇产科。

PMID： 28977852
预防性维修识别码： PMC5617412
内政部： 10.18632/目标18024

摘要

越来越多的证据表明，卵巢高级浆液性癌（HGSC）起源于输卵管上皮，并作为次要部位转移到卵巢。一个可行的假设是，脱落的输卵管HGSC细胞在失巢症中存活并植入卵巢。在本研究中，我们发现降钙素h1（CNN1）对失巢凋亡存活和细胞转化是必要的。CNN1在代表输卵管上皮细胞（FTE）HGSC发育不同阶段的细胞和组织中逐渐下调。在永生化人类FTE细胞中敲除CNN1后，NSG小鼠获得了抗失巢凋亡和转化表型，包括锚定非依赖性生长（AIG）和异种移植瘤发生。相反，在RAS转化的FTE细胞中CNN1的过度表达导致AIG几乎完全丧失和肿瘤发生。此外，细胞形态发生了巨大变化，从多边形的凸起外观变为圆形的扁平外观。还观察到细胞对层粘连蛋白和胶原的粘附增加，细胞运动、抗失巢凋亡和侵袭性降低。微阵列分析显示，参与细胞骨架稳定和信号转导的基因上调，参与细胞因子和趋化因子活性的基因下调。该研究揭示了CNN1在输卵管HGSC发育中的多种抑癌作用，CNN1表达的缺失对其转移到新部位至关重要。

关键词：Calponin h1（CNN1）；失巢症；输卵管上皮；高级别浆液性癌；卵巢癌。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突提交人声明他们没有任何利益冲突。

数字

**图1。RAS转化的人伞上皮细胞系的特性**
(A类)初步培养人伞上皮细胞（FTE），用pLenti-E6/E7和pLenti-hTERT转导。获得永生化细胞系FE25。通过pLenti-Ras的额外转导^V12版本癌基因，FE-RAS细胞。Western blot结果显示RAS、PAX8、p53、HPV E6和E7在FE25和FE-RAS细胞中的表达模式。(B)将FE-RAS细胞的异种肿瘤皮下（上面板）和腹腔（下面板）注射到NSG小鼠中的免疫组织化学。比例尺：50μm。

**图2。CNN1在HGSC的发展和卵巢癌细胞的侵袭进展中下调**
(A类)定量RT-PCR和Western blot(B)对原代培养的菌毛上皮细胞（FTEC，给定病例号）、菌毛上皮刮除物（FE，给定病例号作为前缀）以及永生化（FE25）和转化（FE-RAS）的菌毛上皮细胞系、两种卵巢HGSC细胞系（Kuramochi，OVSAHO）中的CNN1的分析，和两种常见的卵巢癌细胞系（SKOV3、A1847）及其侵袭性亚克隆（I6和I4）。(C类)卵巢HGSC组织中CNN1的定量RT-PCR分析（OV-T，n个=6），输卵管HGSC（FT-T，n个=3），正常卵巢（OV-N，n个=6），正常输卵管伞（FT-N，n个=5）以及正常伞上皮（FE-N，n个= 9). **P（P）*-值<0.05***P（P）*-值<0.01****P（P）*-值<0.001。(D类)来自卵巢（OV-T）和输卵管（FT-T）的临床HGSC标本中CNN1表达的Western blot分析。(E类)正常输卵管伞和HGSC组织中CNN1表达的免疫组织化学分析。

**图3。FE25细胞中CNN1的敲除增强了抗失巢凋亡、集落形成和异种移植瘤形成，但没有增强细胞运动**
分析用细胞神经网络1 shRNA（shCNN1）或阴性对照（shNC）转染的FE25细胞的稳定克隆的蛋白质表达(A类)，细胞增殖(B)、Transwell迁移(C类)，细胞失巢(D类)直径>20μm的菌落的非锚定生长(E类)NSG小鼠异种移植瘤的发生(F类)如材料和方法所述。在anoikis分析中，分析了shCNN1的两个独立稳定克隆（shCNN1#3和shCNN1#10）。在AIG测定中，对直径大于20μm的菌落进行计数。皮下或腹腔注射CNN1敲除的FE25细胞（FE25 shCNN1）5.5个月后观察到异种移植瘤(n个=5，2例有s.c，3例有i.p.）或CNN1-正常FE25细胞（FE25 CTL）(n个=10，5转染shNC，5不转染）。腹腔注射三个shNC转染的FE25细胞。其他人接受皮下注射*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001.

**图4。FE-RAS细胞中CNN1的过度表达导致细胞形态和细胞骨架分布的改变**
(A类)转染载体和CNN1的FE-RAS细胞中CNN1的Western blot。(B)转染GFP载体对照（上面板）和GFP-CNN1（下面板）的FE-RAS细胞的免疫荧光染色。蓝色：DAPI。红色：肌动蛋白。绿色：转染GFP或GFP-CNN1。肌动蛋白和CNN1在重叠区域共定位（黄色）。比例尺：50μm。单元格边缘用虚线标记。

**图5。FE-RAS细胞中CNN1的过度表达导致转化表型的抑制**
(A类)转染CNN1或载体的FE-RAS细胞代表克隆的细胞增殖。(B)不同转染克隆的Transwell细胞迁移试验。(C类)代表克隆的基质侵入试验。(D类)锚定非依赖性生长（AIG）分析。分别对大小>50μm（全部）和>100μm的菌落进行计数。(E类)皮下和(F类)腹腔注射FE-RAS细胞和对照载体或稳定表达的CNN1克隆。在6-8周内处死小鼠。(**G公司**)Anoikis分析：在转染对照载体或CNN1的FE-RAS细胞中检测低附着培养下的细胞活力**P（P）*-值<0.05***P（P）*-值<0.01。显示了不同代表性克隆的结果，包括载体控制的克隆#3、#7和#12，以及CNN1转染的克隆#6、#12和#15。所有的多个克隆都给出了相似的结果。

**图6。整合素α2（ITGA2）和β1（ITGB1）的表达与细胞中CNN1的表达相关，并赋予细胞与不同基质的粘附**
(A类)用控制载体（克隆#12，V）或CNN1（克隆#1，C）转染的FE-RAS细胞中ITGA2、ITGB1和CNN1的表达水平。每个面板下的数字表示带密度的相对定量。(B)不同转染剂的细胞粘附试验：1×10⁴将细胞接种在层粘连蛋白（左面板）或胶原（右面板）上30min，接种前用整合素α2β1抗体预处理或不预处理，并分析细胞粘附情况*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001.

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