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.2017年10月2日；13（10）：e1006661。
doi:10.1371/journal.ppat.1006661。 eCollection 2017年10月。

子宫颈癌细胞系KDM6A成瘾由E7触发，并由p21CIP1抑制复制应激介导

大卫·R·索托 1, 克里斯托弗·巴顿 1, 卡尔·芒格 2, 玛格丽特·麦克劳克林·德鲁宾 1
附属公司

宫颈癌细胞系的KDM6A成瘾由E7触发，并由p21CIP1抑制复制应激介导

大卫·R·索托等。 公共科学图书馆-病理学. .

摘要

致癌高危人乳头瘤病毒（HPV）编码的E7蛋白的表达触发组蛋白H3赖氨酸27脱甲基酶KDM6A的表达增加。KDM6A的表达对于高危HPV E7表达细胞（包括一些宫颈癌细胞系）的生存是必要的。在这里，我们表明，对高危HPV E7表达作出反应的KDM6A增加会导致细胞周期和DNA复制抑制剂p21CIP1的表观遗传去表达，而p21CIP1的表达对高危HPV-E7表达细胞的生存是必要的。高危HPV E7表达细胞存活对KDM6A和p21CIP1表达的要求是基于p21CIP1通过PCNA结合抑制DNA复制的能力。我们发现，细胞复制因子的异位表达可以缓解p21CIP1和KDM6A缺失导致的细胞活性丧失。此外，我们发现补充核苷将覆盖p21CIP1缺失导致的细胞活性丧失，这表明p21CIP1缺失会导致致命的复制应激。KDM6A或p21CIP1缺失时双链DNA断裂增加，以及在高危HPV E7表达细胞中KDM6A或p21CCP1缺失后DNA重组异常，进一步支持了该模型。因此，KDM6A和p21CIP1的表达对于将E7诱导的复制应激抑制到不显著干扰细胞活力的水平至关重要。

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数字

图1
图1。高危而非低危HPV E7蛋白诱导KDM6A表达。
（A）定量实时RT-PCR分析HFK和HFK/E7细胞中KDM6A mRNA的表达。（B）HFK和HFK/E7细胞中HPV E7 mRNA表达的绝对定量。（C）定量实时RT-PCR分析HFK细胞、HPV16阳性CaSki和SiHa宫颈癌细胞株、HPV39阳性宫颈癌细胞系Me-180和HPV18阳性宫颈癌癌细胞系HeLa中KDM6A mRNA的表达。柱状图显示了三个独立实验的平均值和标准偏差，每个实验一式三份。HPV16和18 E7表达细胞以及HPV阳性CaSki、SiHa、Me-180和HeLa细胞的增加具有统计学意义（**）P（P）值<0.01。
图2
图2。KDM6A成瘾是由HPV E7蛋白引起的。
（A）,B）HPV16阳性的SiHa和CaSki宫颈癌细胞株、HPV39阳性的宫颈癌细胞系Me-180和HPV18阳性的宫颈肿瘤细胞系HeLa中KDM6A缺失；（A）通过减少瑞沙唑啉测定细胞存活率。在SiHa细胞的初始实验中使用了三种独立的KDM6A shRNA结构（60、61和62）；（B）定量实时RT-PCR验证KDM6A缺失；（C-F）表达对照载体HPV16 E7、E6或E6和E7的HFK中KDM6A缺失；（C）通过减少瑞沙唑啉测定细胞存活率；（D）通过实时定量RT-PCR验证HPV E7的表达，并与SiHa和CaSki宫颈癌细胞中的水平进行比较；（E）由于缺乏适当的抗体，通过评估p53水平来确定HPV16 E6的表达，通过p53的Western blot分析，p53水平由于E6介导的蛋白酶体降解而降低[66]。用SDS/PAGE分离、转移和检测p53。肌动蛋白印迹作为负荷控制；（F）通过定量实时RT-PCR验证KDM6A缺失；（G-I）表达HPV6、HPV11或HPV18 E7的HFK中KDM6A缺失；（G）通过减少瑞沙唑啉测定细胞存活率；（H）通过qRT-PCR测定HPV6 E7、HPV11 E7和HPV18 E7 mRNA水平；（一）定量实时RT-PCR验证KDM6A缺失；（J）,K）在多西环素诱导HPV16 E7表达的细胞上，使用KDM6A shRNA构建物或KDMA6A特异性siRNA双工体，在U2OS-tet中KDM6A被耗尽。（J）通过减少瑞沙唑啉测定细胞存活率；（K）HPV16 E7和KDM6A的Western blot分析。用SDS/PAGE分离裂解产物，转移并检测HPV16 E7和KDM6A。包括肌动蛋白印迹作为负载对照；（左）HPV16阳性SiHa宫颈癌细胞系中KDM6A缺失。经过10天的嘌呤霉素筛选，用硫罗丹明B染色活细胞；和（百万）通过代表性实验中的荧光激活分类和三个独立实验中的亚G1期百分比确定细胞周期轮廓。显示了三个独立实验的平均值和标准偏差。显示了统计上的重大变化**P（P）< 0.01.
图3
图3。KDM6A成瘾与KDM6B无关。
（A）,B）KDM6A耗尽，KDM6A、KDM6B或p16INK4A（墨水）在HPV16阳性的CaSki宫颈癌细胞系中表达；（A）通过减少瑞沙唑啉测定细胞存活率；（B）定量实时RT-PCR验证耗竭和表达；（C）,D）在HPV16阳性的CaSki宫颈癌细胞系中，通过转染CDK4-和CDK6-特异性siRNA双工体来去除CDK4和CDK6；（C）通过减少瑞沙唑啉测定细胞存活率；（D）通过定量实时RT-PCR验证了耗竭，显示了三个独立实验的平均值和SDs。指示了统计上显著的变化**P（P）< 0.01.
图4
图4。KDM6A成瘾由p21介导CIP1级.
（A-C）第21页CIP1级在HPV16阳性的CaSki和SiHa宫颈癌细胞株以及HPV39阳性的Me-180宫颈癌细胞系中被耗尽。六个独立p21密码1在CaSki细胞系和两个独立的p21的初始实验中使用了shRNA结构（123、125、126、127、400和401CIP1级shRNA表达载体（123和127）用于SiHa和Me-180细胞系；（A）通过减少瑞沙唑啉测定细胞存活率；（B）第21页CIP1级Western blot证实CaSki细胞系中的缺失。用SDS/PAGE分离裂解产物，转移并探测p21CIP1级.肌动蛋白印迹作为加载控制；（C）第21页密码1定量实时RT-PCR验证了SiHa和Me-180细胞系中的缺失；（D）,E）第21页CIP1级在表达HPV6、HPV11、HPV16和HPV18 E7的HFK中缺失；（D）通过减少瑞沙唑啉测定细胞存活率；（E）第21页CIP1级通过定量实时RT-PCR验证耗尽；（F）,G）第21页CIP1级在多西环素诱导HPV16 E7表达的细胞上，U2OS-tet中缺失；（F）通过减少瑞沙唑啉测定细胞存活率；（G）第21页CIP1级通过Western blot验证缺失。用SDS/PAGE分离裂解产物，转移并探测p21CIP1级.肌动蛋白印迹作为加载控制；（H）第21页CIP1级在HPV16阳性的SiHa宫颈癌细胞系中被耗尽。在选择嘌呤霉素10天后，用硫罗丹明B对活细胞进行染色。条形图显示了三个实验中活细胞的平均百分比；（一）通过代表性实验中的荧光激活分类和三个独立实验中的亚G1期百分比确定细胞周期轮廓；（J）,K）KDM6A耗尽，p21CIP1级在HPV16阳性的CaSki宫颈癌细胞系中表达；（J）通过减少瑞沙唑啉测定细胞存活率；（K）通过免疫印迹法验证耗竭和表达。用SDS/PAGE分离裂解产物，转移并检测KDM6A和p21CIP1级包括肌动蛋白印迹作为负载对照；（升,M）KDM6B耗尽，p21CIP1级在HPV16阳性的CaSki宫颈癌细胞系中表达；(L）通过减少瑞沙唑啉测定细胞存活率；（百万）通过免疫印迹法验证耗竭和表达。用SDS/PAGE分离裂解产物，转移并检测KDM6B和p21CIP1级.肌动蛋白印迹作为加载控制；（N）HPV16阳性的CaSki宫颈癌细胞和p21中KDM6A缺失密码1转染后72小时通过Western blotting分析表达。肌动蛋白印迹显示为负载控制。（O）ChIP使用SiHa细胞的裂解物，使用H3K27me3或阴性对照IgG的特异性抗体进行分析。qPCR用于测量富集程度，以及捕获p21中-4 kB和-2 kB位点的每个引物对的结果CIP1级启动子以结合/输入的百分比表示。统计上的重大变化(P（P）<0.05）用星号表示。测定了IgG的折叠富集，并显示了在p21中捕获-4 kB和-2 kB位点的每个引物对CIP1级发起人。显示了三个独立实验的平均值和标准偏差。显示了统计上的重大变化**P（P）< 0.01.
图5
图5。p21对KDM6A成瘾的挽救作用CIP1级取决于PCNA结合位点的完整性。
（A）,B）CDK2抑制剂p27的异位表达知识产权1缺乏PCNA相互作用，不能挽救KDM6A或p21的丢失CIP1级KDM6A或p21CIP1级在HPV16阳性的CaSki宫颈癌细胞系中缺失，p27表达；（A）通过减少瑞沙唑啉测定细胞存活率；（B）通过定量实时RT-PCR验证消耗和表达；（C）,D）p21的C末端PCNA结构域的异位表达CIP1级拯救KDM6A成瘾，而p21的N末端CDK2抑制剂域的表达CIP1级，PCNA结合缺陷p21CIP1级突变体，或显性阴性突变体未能拯救；C）通过减少瑞沙唑啉测定细胞存活率；（D）通过免疫印迹验证其表达。通过SDS/PAGE分离裂解物，转移并探测p21CIP1级.肌动蛋白印迹作为加载控制。实验在CaSki细胞中进行，条形图表示三个实验的平均值和SD。显示了统计上的重大变化**P（P）< 0.01.
图6
图6。KDM6A/p21导致生存能力下降CIP1级E7表达细胞的缺失可能是复制应激的结果。
（A）,B）CDC7/DBF4激酶的耗竭可以挽救KDM6A的丢失。每个shKDM6A+shCDC7+shDBF4耗尽都包含shKDM5A 60和shCDC7和shDBF4s的以下组合，顺序为：shCDC7168/shDBF4 954、shCDC7-169/shDBF 955、shCDC 7170/shDBF1 956、shCDC171/shDBF2957、shCDC27 169/shDBF1954和shCDC172/shDBB4 957；（A）通过减少瑞沙唑啉测定细胞存活率；（B）定量实时RT-PCR验证耗竭；（C）,D）CDT1耗竭拯救KDM6A和p21密码1损失；（C）通过减少瑞沙唑啉测定细胞存活率；（B）定量实时RT-PCR验证耗竭；（E）,F）用外源性核苷补充表达E7的CaSki细胞抑制p21引起的细胞死亡CIP1级消耗。第21页CIP1级在含有多西环素诱导的HPV16 E7表达的U2OS骨肉瘤细胞中被耗尽，并在培养基中补充50μM核苷或在标准条件下生长；（E）通过减少瑞沙唑啉测定细胞存活率；（F）通过免疫印迹验证消耗。裂解产物通过SDS/PAGE分离、转移和探测p21密码1.肌动蛋白印迹作为加载控制。条形图表示三个实验的平均值和标准偏差，显示了统计上显著的变化**P（P）< 0.01.
图7
图7。KDM6A/p21基因CIP1级E7表达细胞的缺失导致53BP1核病灶的形成。
KDM6A或p21CIP1级在HPV16阳性的SiHa宫颈癌细胞中被耗尽。（A）用53BP1抗体对细胞进行免疫染色；（B）每个实验中100个细胞中的53BP1核病灶被量化；和（C）KDM6A/p21上每核53BP1核病灶的定量CIP1级消耗。条形图表示六个实验的平均值和标准偏差，显示了统计上显著的变化**P（P）< 0.01.
图8
图8。KDM6A/第21页CIP1级E7表达细胞的缺失导致再复制。
KDM6A或p21CIP1级在HPV16阳性的SiHa宫颈癌细胞中被耗尽。标记有IdU（绿色）和CldU（红色）的单梳DNA分子示例。
图9
图9
第21页CIP1级正常（A）高危HPV E6/E7表达细胞（B）和KDM6A和/或p21缺失的高危HPV E6/E7表示细胞中的调节电路CIP1级（C） ●●●●。详见正文。
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