Hexokinases link DJ-1 to the PINK1/parkin pathway

doi:10.1186/s13024-017-0212-x

.2017年9月29日；12(1):70.

doi:10.1186/s13024-017-0212-x。

己糖激酶将DJ-1连接到PINK1/parkin途径

附属公司

¹美国马里兰州贝塞斯达，MSC 3707，Convent Drive 35号楼35号，1A116室，国立卫生研究院国家老龄研究所神经遗传学实验室，细胞生物学和基因表达科，邮编：20892-3707。
²美国马里兰州巴尔的摩国立卫生研究院国家老龄研究所转化老年学分所实验老年学科。
^三美国佛罗里达州杰克逊维尔梅奥诊所神经科学系。
⁴美国佛罗里达州杰克逊维尔市梅奥诊所生物医学研究生院。
⁵美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家神经疾病和中风研究所蛋白质/肽测序设施。
⁶美国马里兰州贝塞斯达，MSC 3707，Convent Drive 35号楼35号，1A116室，国立卫生研究院国家老龄研究所神经遗传学实验室，细胞生物学和基因表达科，邮编：20892-3707。Cookson@mail.nih.gov。

PMID： 28962651
预防性维修识别码：项目编号：5622528
内政部： 10.1186/s13024-017-0212-x

己糖激酶将DJ-1连接到PINK1/parkin途径

大卫·N·豪泽等。摩尔神经变性剂. 2017.

.2017年9月29日；12(1):70.

doi:10.1186/s13024-017-0212-x。

附属公司

¹美国国立卫生研究院国家老龄化研究所神经遗传学实验室细胞生物学和基因表达科，美国马里兰州贝塞斯达市MSC 3707 Convent Drive 35号1A116室35号楼，邮编：20892-3707。
²美国马里兰州巴尔的摩国立卫生研究院国家老龄研究所转化老年学分所实验老年学科。
^三美国佛罗里达州杰克逊维尔梅奥诊所神经科学系。
⁴美国佛罗里达州杰克逊维尔市梅奥诊所生物医学研究生院。
⁵美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家神经疾病和中风研究所蛋白质/肽测序设施。
⁶美国马里兰州贝塞斯达，MSC 3707，Convent Drive 35号楼35号，1A116室，国立卫生研究院国家老龄研究所神经遗传学实验室，细胞生物学和基因表达科，邮编：20892-3707。Cookson@mail.nih.gov。

PMID： 28962651
预防性维修识别码：项目编号：5622528
内政部： 10.1186/s13024-017-0212-x

摘要

背景：早发性帕金森病是由PINK1、parkin和DJ-1的变异引起的。PINK1和parkin在保护线粒体完整性的途径中运行，但DJ-1的功能及其与PINK1和parkins的关系尚不清楚。

方法：使用一系列无偏见的高含量筛选来分析缺乏DJ-1的啮齿动物大脑中蛋白质、RNA和代谢物水平的变化。使用靶向方法验证结果，并进行细胞分析以探索相关机制。

结果：我们发现，在大鼠和小鼠大脑中，DJ-1基因敲除导致己糖激酶1在细胞液中的年龄依赖性积累，远离其通常位于线粒体的位置，随后激活体内葡萄糖代谢的多元醇途径。在大脑和培养细胞中，DJ-1缺乏与拮抗激酶AKT的磷酸酶PTEN的积累有关。在细胞中，添加AKT抑制剂（MK2206）或添加肽以分离线粒体己糖激酶的结合，都会抑制PINK1/parkin通路，该通路起到维持线粒体完整性的作用。

结论：己糖激酶是早发性帕金森病三大遗传原因之间的重要联系。由于衰老与放松营养素感应有关，这些结果有助于解释为什么DJ-1与年龄依赖性疾病有关。

关键词：AKT；DJ-1；己糖激酶；代谢组学；线粒体；粉红色1；帕金；帕金森病；蛋白质组学；RNA-Seq；系统生物学。

PubMed免责声明

利益冲突声明

道德批准和参与同意

本研究严格按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议进行。该方案名为463-LNG-2018，由美国国家老龄化研究所的机构动物护理和使用委员会批准。

出版同意书

不适用。

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

出版商备注

Springer Nature在公布的地图和机构关联中的管辖权主张方面保持中立。

数字

图1
蛋白质组学筛选确定DJ-1基因敲除啮齿动物大脑中细胞溶质HK1的增加。一-b条火山图显示线粒体富集组分中994个蛋白质的丰度(一)和957种富含胞质溶胶的组分中的蛋白质(b条)6个月大的雄性大鼠大脑(n个=7重量，n=7 DJ-1淘汰赛）。显著改变的蛋白质（Benjamini Hochberg（BH）调节的Welch’st吨-测试第页<0.05）标记其官方基因名称。为了清晰起见，图中省略了DJ-1点，但位于（−2.237，10.02）英寸(一)和（−2.95，8.99）英寸(b条). (**c（c）**)14-15个月龄小鼠脑中细胞溶质富集部分定量的742个蛋白质的火山图(n个=9重量（5米，4华氏度），n个=5 DJ-1击倒（3 M，2 F））。NEFL、NEFM和NEFH已标记，但未达到统计显著性（BH调整的Welch’st吨-试验p<0.05）。图中省略了DJ-1，但位于（−1.99，3.97）。(d日-**（f）**)Western blots显示大鼠脑细胞溶质富集部分HK1蛋白水平(d日，6个月大的雄性，n个=7 WT，7 DJ-1基因敲除），1个月大的小鼠大脑(电子,n个=8重量（4米，4华氏度），n个=8个DJ-1基因敲除（4 M，4 F），4个月大的小鼠大脑(**（f）**，n=9重量（4 M，5 F），n个=8只DJ-1基因敲除小鼠（5 M，3 F），14-15个月大的小鼠大脑(克,n个=9重量（5米，4华氏度），n个=5 DJ-1击倒（3 M，2 F））。β-肌动蛋白作为负荷对照。图表显示平均值、平均值标准误差（SEM），*表示第页<0.05（韦尔奇t吨-测试）

图2
己糖激酶在脑中的表达和由DJ-1缺失引起的HK1线粒体分离。一基于从GTEx下载的数据，四个己糖激酶基因在人脑不同区域的表达水平。b条1岁WT小鼠脑冠状切片中的HK1免疫反应显示该蛋白普遍表达。比例尺：500μm。**c（c）**-d日小鼠多巴胺能SNpc神经元中HK1的表达。线粒体TOM20染色，酪氨酸羟化酶（TH）是多巴胺能神经元的标记物。比例尺**c（c）**：200μm，比例尺d日：5μm。电子1岁WT小鼠和1岁DJ-1基因敲除小鼠SNpc中单个TH阳性神经元的高分辨率图像。HK1显示为绿色，线粒体标记TOM20显示为粉红色，白色像素表示两个信号重叠。比例尺：2μm。**（f）**1岁小鼠多巴胺能SNpc神经元HK1信号强度(n个=5重量（1米，4英尺），n个=7（3 M，4 F）DJ-1击倒）。每只小鼠五个神经元的强度值(n个=25个WT电池，n个=35个DJ-1敲除细胞）显示在箱线图中，根据Tukey方法绘制胡须，异常值显示为黑点。将数据拟合到线性模型中第页基因型影响的方差分析测试值显示在图表下方。克1岁小鼠多巴胺能SNpc神经元中HK1和TOM20信号共定位。数据来自与(**（f）**)、和被绘制并比较为(**（f）**)带*表示第页 < 0.05

图3
激活DJ-1基因敲除小鼠大脑中葡萄糖代谢的多元醇途径。一-**（f）**显示WT和DJ-1基因敲除小鼠大脑中1,5-脱水葡萄糖醇、果糖、DHAP、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸和果糖-1,6-二磷酸水平的图表。在4个月大的小鼠大脑中，使用240种生化物质的高含量代谢组学筛选测定代谢物水平(n个=13重量（8米，5英尺），n个=12 DJ-1击倒（6 M，6F））。韦尔奇的成绩t吨-使用BH方法的多个测试的带修正和不带修正测试显示在每个图表下方。*表示p_形容词 < 0.05.克DJ-1基因敲除小鼠大脑中葡萄糖代谢物的变化总结。注意，颜色表示多次测试校正前的重要性

图4
DJ-1基因敲除大鼠脑的RNA-Seq谱显示AKT信号改变。一从6月龄雄性大鼠脑中分离的mRNA中使用RNA-Seq量化15537 mRNA转录物的火山图说明DJ-1缺失的影响(n个=8重量，n个=6 DJ-1击倒）。DJ-1基因敲除大鼠大脑中有2000多个基因差异表达（BH调整后p<0.05）。基因被原木着色₁₀基本平均值表达式。b条-**c（c）**十大维基解密(b条)和KEGG途径(**c（c）**)来自DJ-1基因敲除中差异表达mRNA的显著富集：WT RNA-Seq比较。随机出现在列表中的基因数量以灰色表示，整个条表示观察到的数量。d日AKT调节激活靶基因的下游转录因子，导致与WT大鼠大脑相比，DJ-1基因敲除中差异表达的mRNA显著过度表达。预期和观察到的基因数量如所示(b条)和(**c（c）**).电子Western blot显示6月龄雄性大鼠全脑匀浆中总AKT、pAKT S473、DJ-1和β-肌动蛋白的水平(n个=7重量，n个=7 DJ-1淘汰赛）。将pAKT S473与总AKT的比值进行归一化，并如图1d.*所示绘制图表，第页<0.05

图5
DJ-1缺陷对PTEN/PI3K/AKT/GSK3β信号级联的影响。一Western blot显示IGF-1刺激5分钟后WT和DJ-1基因敲除小鼠初级星形胶质细胞中pAKT T308、pAKT S473和pGSK-3βS9的水平(n个=4重量，n个=3 DJ-1基因敲除，培养物取自不同的动物）。还显示了AKT、GSK-3β和β-肌动蛋白的总水平。b条-d日pAKT T308的量化(b条)，pAKT S473(**c（c）**)和pGSK-3βS9(d日)从中显示的污点(一). 未刺激细胞和Welch氏细胞中未检测到pAKT T308t吨-试验用于评估IGF-1反应(b条). 采用双向方差分析和Bonferroni的多重比较试验(**c（c）**)和(d日).电子-克WT和DJ-1基因敲除小鼠原代星形胶质细胞中PTEN和pPTEN S380的蛋白质印迹和定量(n个=6重量，n个=6 DJ-1淘汰赛，使用技术复制品进行实验）。小时-我免疫印迹法测定14～15月龄WT和DJ-1基因敲除小鼠脑总裂解物中PTEN和pPTEN S380的水平(n个=5重量，n个=3 DJ-1击倒）。未配对t检验用于比较(电子-我)

图6
调节AKT需要DJ-1 C106。用LacZ-V5、野生型DJ-1-V5和C106A DJ-1-V转染初级DJ-1敲除小鼠星形胶质细胞，并用IGF-1刺激5分钟。一V5（红色）、pAKT S473（绿色）和总AKT（粉红色）的免疫细胞化学。比例尺：20μm。b条pAKT S473归一化为总AKT的量化(n个=13个LacZ细胞，n个=20个野生型DJ-1细胞，n个＝14个C106A DJ-1细胞）。采用一元方差分析和Bonferroni的多重比较测试对各组进行比较

图7
AKT信号传导促进PINK1/parkin通路的激活。一与MK2206在HeLa细胞中孵育过夜后，无论有无原核CCCP，线粒体膜电位。b条-d日在用10μM CCCP处理1小时之前，用MK2206（10μM）抑制表达YFP-parkin的HeLa细胞中的AKT 24小时，然后免疫沉淀YFP-palkin。免疫沉淀HK2、VDAC1和parkin蛋白的水平如所示(b条)并在中进行量化(**c（c）**)和(d日)（n=在4个单独的实验过程中重复7次，一个样本t吨-测试MK2206/DMSO与1）。电子-克稳定表达YFP-parkin和MitodsRed2的HeLa细胞在用CCCP（5μM）处理1h之前用MK2206（10μM）进行处理，并用高含量成像分析细胞。Hoechst（细胞核）、YFP-parkin、MitodsRed2和pUbiquitin S65的显微照片如所示(电子). YFP-parkin和MitodsRed2之间重叠的量化如所示(**（f）**)线粒体中泛素S65的强度显示为(克) (n个=400个细胞/孔，每个条件5个孔）。采用双向方差分析和Bonferroni的多重比较检验对各组进行比较。比例尺：50μm。小时稳定表达YFP-parkin和MitodsRed2的HeLa细胞在用缬霉素（10μM）处理2h之前用MK2206处理。我YFP-parkin与MitodsRed2重叠的量化(小时) (n个=400个细胞/孔，每种情况下11–12个孔）。比较和比例尺，如所示(电子-克)

图8
HK2的细胞溶胶积累抑制PINK1/parkin通路。一-**c（c）**在用5μM CCCP处理1小时之前，使用源自HK2 VDAC结合域（HK2VBD）的肽将HK2从HeLa细胞线粒体中分离30分钟。图像和量化显示如图6所示

图9
己糖激酶将DJ-1连接到PINK1/parkin通路。一通过PI3K/AKT途径的正常信号传导。DJ-1负调控PTEN，促进AKT的信号转导。b条在没有DJ-1的情况下发出PI3K/AKT信号。在没有DJ-1负调控的情况下，PTEN抑制AKT信号传导。**c（c）**DJ-1缺失对PI3K/AKT/GSK-3β的影响，再加上衰老的特征（例如，营养感应失控和线粒体功能障碍），导致细胞液中HK1的积累和老年啮齿动物大脑中多元醇通路的激活。d日促进己糖激酶从VDAC中分离，抑制AKT，降低己糖激酶mRNA，都能抑制帕金转位到永生化细胞去极化线粒体。有关HK1/2 shRNA和除MK2206外的其他AKT抑制剂的详细信息，请参见[41]

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