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.2017年9月29日；11（9）：e0005976。
doi:10.1371/journal.pntd.0005976。 eCollection 2017年9月。

基孔肯雅病毒从埃及伊蚊中肠传播与血样消化过程中颞叶基底膜降解有关

Shengzhang Dong先生 1, Velmurugan Balaraman公司 1, 阿舍·M·坎特 1, 林静怡 1, DeAna G Grant公司 2, Nicole L持有 1, 亚历山大·W·E·弗兰兹 1
附属公司

基孔肯雅病毒从埃及伊蚊中肠传播与血样消化过程中颞叶基底膜降解有关

Shengzhang Dong先生等。 PLoS Negl Trop Dis网站. .

摘要

在蚊子中，中肠上皮是感染节肢动物传播病毒（虫媒病毒）的最初组织，该病毒是从脊椎动物宿主和病毒血症血样中获得的。病毒在中肠上皮细胞中复制后，需要离开中肠并感染次级组织，包括唾液腺，然后才能传播到另一脊椎动物宿主。病毒从中肠的退出机制，即中肠逃逸屏障（MEB），目前尚不清楚，尽管它是虫媒病毒蚊子媒介能力的重要决定因素。以基孔肯雅病毒（CHIKV）为埃及伊蚊模型，我们证明中肠周围细胞外基质（ECM）的基底层（BL）构成病毒的潜在屏障。BL主要由IV型胶原蛋白和层粘连蛋白组成，在中肠内腔的血样消化过程中变得宽松。血块消化、BL容许性和CHIKV传播与胶原酶活性增加、IV型胶原丰度降低以及BL在餐后24-32小时中肠粉碎一致。这表明埃及伊蚊中的MEB可能存在一个机会窗口，在此期间，CHIKV被允许使用。基质金属蛋白酶（MMPs）是负责包括BL在内的ECM降解/重塑的主要细胞外内肽酶。我们重点研究埃及伊蚊（Ae.aegypti，Ae）MMP1，它在中肠上皮细胞中表达，在吸血时可诱导，并显示胶原酶（明胶酶）活性。然而，试图抑制AeMMP的一般或特定活性似乎并没有影响其功能，也没有改变中肠逃避表型。另外，我们在蚊子中肠沉默并过度表达埃及伊蚊金属蛋白酶组织抑制剂（AeTIMP）。在血粉消化过程中，AeTIMP在中肠中高度上调，并且能够在体外抑制MMP活性。AeTIMP在血液中可诱导中肠特异性过度表达或通过重组CHIKV表达，显著增加了病毒的中肠传播率。AeTIMP过表达可能影响BL降解和/或恢复，从而提高病毒的中肠传播效率。

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数字

图1
图1。中肠基底膜（BL）是CHIKV传播的屏障，当中肠出现血样时，这是允许的。
第1组蚊子(G1号)：千伏（105pfu/ml）胸腔内注射到雌性体内，然后维持糖饮食。注射后4天对中肠进行分析。第2组蚊子(G2级)：将CHIVV胸腔内注射到雌性体内，第二天接受血腥治疗。在喂血后3天对中肠进行分析。第3组蚊子(G3（G3）)：在感染后4天（dpi），口服CHIKV并进行血样和中肠分析。（A）使用CHIKV特异性单克隆抗体，在4dpi下基于免疫荧光分析检测G1、G2和G3蚊子中肠组织中的CHIKV抗原（绿色）。白色和蓝色箭头分别表示与气管细胞和中肠上皮细胞相关的病毒抗原。棒材=100μm。（B）超微结构TEM图像显示了蚊子在注射CHIKV后4天的中肠组织横截面（G1:BL包围中肠相关肌肉附近的上皮；G2：带有基底迷路和ER的上皮）和喂血后4天（G3:BL包围靠近中肠相关肌的上皮）。红色箭头表示病毒；每个图像上都显示了比例尺。每个图像代表不同的中肠样本。注：G1期上皮内未见病毒。黑框内的两幅图像（不属于G3）取自未感染的样本，提供了中肠亚细胞组织的概述。缩写：BL，基膜；ep，上皮；mu，肌肉；b-lab，基底迷路；ER，内质网；mv，微绒毛；nu，细胞核；tr，气管细胞。（C）通过Vero细胞中的菌斑试验测定的G1、G2和G3蚊子中肠组织在4 dpi下的CHIKV滴度（pfu）/ml）。P（P）-值通过Mann-Whitney U检验确定。（D）糖食和血食HWE雌性中肠表面结构的超微结构SEM图像。缩写：mu，muscle；tr，气管细胞。
图2
图2。中肠BL相关的IV型胶原蛋白在血粉消化过程中减少，这与12~36小时前中肠胶原酶活性增加一致。
（A）用人IV型胶原多克隆抗体Western blot检测吸血后不同时间点蚊子中肠和糖食蚊子中肠中的IV型胶原；检测到IV型胶原（Col IVα）的两条α链。β-actin作为负荷对照。标出了标准分子尺寸。（B）SDS-PAGE用于检测人胎盘I型胶原蛋白，该胶原蛋白与蚊子中肠制备的裂解物在不同时间点pbm孵育。（C） 体外活性测定法检测不同时间点pbm从蚊子中肠制备的裂解物中胶原酶IV的活性。显示了三个独立实验的平均值和标准偏差。根据单向方差分析（ANOVA）和Tukey的多重比较测试（*at第页≤ 0.05).（D）使用针对人IV型胶原产生的多克隆抗体，通过在1天和2天pbm/pi接受非传染性或含有CHIKV的血粉的蚊子的中肠中的蛋白质印迹检测IV型胶原。图a、B、D中所示的图像是重复实验的代表性实例。（E）的图像Ae公司.埃及语HWE雌性，1天pbm。左边的雌性被喂食到饱腹（“饱腹”），中间的雌性被部分喂食（“半饱”），右边的雌性被糖食（没有食物进入中肠）。使用抗人IV型胶原的多克隆抗体，通过Western blot检测在前1天和前2天喂饱（“饱”）或部分饱（“半饱”）的雌性中肠中的IV型胶原；检测到两条IV型胶原α链（Col IVα）。β-actin作为负荷对照。
图3
图3。AeMMP1的活化形式在血粉消化的早期阶段可在中肠中检测到，并且活化的重组AeMMP1具有酶活性在体外.
（A）使用多克隆抗体pAb-mmp1-2通过Western blot检测蚊子中肠在不同时间点的AeMMP1。（aMMP1=AeMMP1的活性形式）。β-actin作为负荷对照。(B）Western blot（左）和明胶酶谱（右）检测重组物的催化活性形式，果蝇属S2细胞表达（r）AeMMP1。白色箭头表示rAeMMP1的催化活性形式。(C）细胞中rAeMMP1活性的动力学在体外以FS-6为底物的基质金属蛋白酶活性测定。在活性测定开始之前，将20 ng rAeMMP1与1 mM proMMP激活剂4-氨基苯汞醋酸盐（AMPA）或反应缓冲液预培养1 h。空白，rAeMMP1：分别转染“空”质粒载体和rAeMMP1表达质粒的细胞培养基；空白1 h，rAeMMP1 1 h：在FS-6底物孵育之前，用1 mM AMPA预孵育培养基1 h。(D类)GM6001、EDTA或HuTIMP3介导rAeMMP1抑制的动力学。将20 ng HuTIMP3、0.4 mM GM6001、2.5 mM GM600或2.5 mM EDTA与10 ng rAeMMP1在RT下预孵育2 h，然后添加FS-6底物。每20分钟测量一次荧光强度。
图4
图4。重组AeTIMP抑制MMP活性在体外.
(A类)SDS-PAGE（左）显示纯化rAeTIMP在HEK293T细胞中表达后的~30kDa带信号；用单克隆抗His-tag抗体检测纯化rAeTIMP的Western blot（右）。空白，rAeTIMP:HEK293T细胞分别转染“空”质粒或AeTIMP表达质粒。(B)rAeTIMP介导抑制人MMP1的动力学(C类)人类MMP2(D类)人类MMP3。将4 ng或20 ng rAeTIMP或缓冲液与20 ng每种MMP在RT下孵育2小时，然后添加FS-6或DQ明胶（仅限人类MMP2）底物，再孵育两小时。每20分钟测量一次荧光强度(E类)rAeTIMP介导的rAeMMP1和(F类)rAeMMP2。将10 ng rAeMMP1或rAe MMP2与10 ng、20 ng或50 ng rAe TIMP在RT下孵育2 h，然后添加FS-6底物。图B-F是多个实验的代表性例子。
图5
图5。AeTIMP在蚊子中肠中的表达谱及其通过重组CHIKV的过度表达导致尸体感染率增加。
（A） Aetimp公司qRT-PCR检测到在1、2、4和7天pbm/pi时接受非感染性或含CHIKV血粉的HWE蚊子中肠的表达谱。显示了三个独立实验的平均值和标准偏差（SD）。由Student’s确定糖化对照和血源/CHIKV感染样本之间的显著性t吨-测试（*在第页≤0.05，**在第页≤ 0.01).（B）重组CHIKV-TIMP示意图版本5基于CHIKV菌株2006 LR-OPY1构建，该菌株在E1中含有A226V氨基酸变化。对病毒cDNA克隆进行工程设计，使其复制的用于基因表达的亚基因组启动子位于结构基因的上游。（C）CHIKV-TIMP的限制性酶消化版本5和CHIKV-EGFP质粒抗坏血酸我和个人电脑我展示了感兴趣的基因插入和病毒克隆的剩余全长cDNA。（D）尸体感染率和（E）在采集含有10种病毒的血样后，蚊子尸体的病毒滴度为4dpi7pfu/ml CHIKV-TIMP公司版本5或CHIKV-EGFP。Fisher精确测试用于确定第页-中的值（D）.英寸（E），每个数据点代表单个胴体的CHIKV滴度。P（P）-值通过Mann-Whitney U检验确定。黑色条表示中间带。
图6
图6。转基因介导的AeTIMP过度表达版本5P4系吸血蚊子的中肠。
（A）的示意图水手Mos1过度表达AeTIMP的TE结构版本5在血粉诱导的中肠特异性药物的控制下美国注册会计师协会发起人。缩写：ma.left，ma.right=左，右手臂水手Mos1；美国注册会计师协会=Ae公司.埃及肽羧肽酶A发起人；猴病毒40 VP1基因多聚腺苷酸化信号；3xP3=眼部组织特异性启动子。(B、 C类)种系转化实验数据和获得的转基因G0创始人。（D）AeTIMP的检测版本5用V5标记特异性单克隆抗体进行Western blot，在血餐后不同时间点在转基因品系P4的中肠中进行检测。β-actin作为负荷对照。箭头表示AeTIMP版本5蛋白质。（E）免疫荧光法检测转基因AeTIMP版本524小时前，P4蚊子中肠组织中的抗原（绿色）。使用特异性单克隆抗体检测V5标签抗原。细胞核用DAPI（蓝色）染色。棒材=40μm（前两排）和200μm（第三排）。（F）RT-PCR检测转基因表达的AeTIMP版本5以及24小时前半时P4蚊子各种组织中的内源性AeTIMP。缩写：TH=胸部；FB=脂肪体；HD=头部组织；MT=马尔皮奇小管；MG=中肠；MWB=全身雄性；CA=胴体。
图7
图7。转基因介导的AeTIMP过度表达版本5在血液喂养的P4蚊子的中肠中增加了CHIKV传播效率和DENV4全身滴度、感染率。
（A）单个HWE和（G）的CHIKV滴度4)P4屠体和（B）在Vero细胞中通过噬斑分析分析在1、2、4、7dpi下的中肠。每个数据点代表单个中肠或胴体的CHIKV滴度。黑色条表示中间带。只有受感染的蚊子才被纳入统计分析，使用Mann-Whitney U型检验来确定第页-值。（C）通过Vero细胞中的菌斑分析，在1、2、4、7dpi下HWE和P4蚊子尸体中的CHIKV感染率。Fisher精确测试用于确定第页-值。（D）单个HWE和P4蚊子的DENV4（菌株：H-241）滴度以及（E）通过BHK21细胞中的菌斑试验分析了7和14dpi时HWE和P4蚊子的DENV4感染率。按照A-C进行统计分析。面板A-E中的图形是重复实验的典型示例。的比较（F）通用MMP和（G）使用通用MMP和DQ IV型胶原蛋白底物，HWE和P4蚊子中肠在前1、2、4天的胶原酶IV活性。根据单向方差分析（ANOVA）和Tukey的多重比较测试（*at第页≤ 0.05).
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