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.2017年9月28日；549(7673):523-527.
doi:10.1038/nature24016。 Epub 2017年9月20日。

ApoE4显著加剧了tau病小鼠模型中tau介导的神经变性

杨石 1, 山田考鲁 2, 谢恩·安东尼·利德洛 3 4, 斯科特·史密斯 5, 赵玲芝 6, 罗文杰 6, 理查德·蔡英文 7, Salvatore Spina公司 7, Lea T Grinberg公司 7 8, 朱利奥·罗哈斯 7, 吉尔伯特·加拉多 1, 王开若 1, 卢武铉 1, 格雷斯·罗宾逊 9, 玛丽·贝丝·芬恩 1, 洪江 1, 帕特里克·M·沙利文 10, 卡罗琳·鲍菲尔德 5, 迈克尔·伍德 11, 考特尼·萨特芬 1, 莉娜·麦奎 12, 熊成杰 12, 豪尔赫·德尔·阿吉拉 13, 约翰·莫里斯 1, 卡洛斯·克鲁查加 13 14; 阿尔茨海默病神经成像倡议; 安妮·M·费根 1, 布鲁斯·米勒 7, 亚当·巴克瑟 7, 威廉·西利 7 8, 奥列格·布托夫斯基 5 15, 本·A·巴雷斯 3, 史蒂文·M·保罗 16, 大卫·M·霍尔兹曼 1
附属公司

ApoE4显著加剧了tau病小鼠模型中tau介导的神经变性

杨石等。 自然. .

摘要

APOE4是晚发性阿尔茨海默病的最强遗传危险因素。与其他ApoE亚型相比，ApoE4增加了大脑淀粉样β病理学。然而，APOE是否独立影响tau病理学、阿尔茨海默病和其他tau病的其他主要蛋白病或tau介导的神经变性尚不清楚。通过在人类ApoE敲除（KI）或ApoE基因敲除（KO）背景下产生P301S tau转基因小鼠，我们发现，与P301S/E2、P301S/E3和P301S/EKO小鼠相比，P301S/E4小鼠在三个月大时大脑中的tau水平显著升高，体脂蛋白tau重分布程度更大。到9个月大时，具有不同ApoE基因型的P301S小鼠显示出不同的磷酸化tau蛋白（p-tau）染色模式。与P301S/E2和P301S/E3小鼠相比，P301S/E4小鼠出现明显更多的脑萎缩和神经炎症，而P301S/E KO小鼠在很大程度上可以免受这些变化的影响。在体外，经脂多糖治疗后，表达E4的小胶质细胞表现出较高的固有免疫反应性。与神经元/E2和神经元/E3共培养相比，P301Sτ表达神经元与E4表达混合胶质细胞共培养可显著提高肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌水平，并显著降低神经元活力。与EKO胶质细胞共同培养的神经元活力最高，分泌的TNF-α水平最低。与缺乏ApoE相比，重组ApoE（E2，E3，E4）治疗P301S神经元也会导致一些神经元损伤和死亡，ApoE4加重了这种影响。在散发性原发性τ蛋白病患者中，ε4等位基因的存在与更严重的区域性神经退行性变有关。在淀粉样蛋白-β病理学阳性且伴有症状性阿尔茨海默病且通常具有tau病理学的个体中，ε4携带者表现出更高的疾病进展率。我们的结果表明，ApoE独立于β淀粉样蛋白病理学影响tau发病机制、神经炎症和tau介导的神经变性。ApoE4具有“毒性”功能，而ApoE的缺失具有保护作用。

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数字

扩展数据图1
扩展数据图1。3月龄TE小鼠或9月龄非金转基因小鼠无脑萎缩或脑容量差异
一，3个月大TE小鼠大脑的代表性图像（重量：n=10，TE2:n=10、TE3:n=10和TE4:n=10，TEKO:n=11）b条，量化梨状/内嗅皮质、海马、后侧脑室容积3个月大的TE小鼠。c（c），9个月大婴儿的代表性图片非金转基因小鼠大脑（WT:n=9，E2:n=8，E3:n=12，E4:n=14，EKO:n=9）。d日,梨状/内嗅皮质、海马、后部的量化9个月大的非tau转基因小鼠的侧脑室容积。数据以平均值±SEM表示，采用Tukey的post-hoc的单向方差分析统计分析采用双侧检验。Kruskal-Wallis检验对后LV进行Dunn多重比较试验体积分析。
扩展数据图2
扩展数据图2。在9个月大的P301S小鼠中，ApoE4导致海马CA1区更严重的神经元丢失
一，9个月龄TE小鼠大脑的代表性图像甲酚紫染色。b条，CA1金字塔的厚度神经元层（WT:n=7，TE2:n=14，TE3:n=11，TE4:n=17，TEKO:n=16）。数据表示为平均值±SEM，单因素方差分析与Tukey的事后检验（双侧）。c（c），CA1神经元层厚度与海马体积。N=62只生物独立动物。皮尔逊相关分析（双侧），p<0.0001，第页2=0.35. *p＜0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
扩展数据图3
扩展数据图3。TE4小鼠中tau水平升高不是由于tau合成差异，可能是由自噬介导的tau清除受损引起的
一，9月龄TE小鼠皮层中人tau的qPCR结果（重量：n=5，TE2，TE3，TE4，TEKO:n=7）。b、 c（c）9个月大婴儿（b）自噬相关基因表达的纳米线分析TE小鼠海马和（c）9个月龄非金转基因ApoEKI或ApoEKO小鼠海马（每组5-6只）。d日，人类3个月RAB分数中的ApoE水平（WT:n=2，TE2:n=15，TE3:n=11，TE4:n=12，TEKO:n=6）和9个月（WT:n=5，TE2:n=14，TE3:n=11，TE4:n=17，TEKO:n=7）老年TE小鼠脑裂解物的测定方法为ELISA法。e、 9个月大的TE小鼠皮层在RIPA缓冲液中裂解蛋白质印迹法评估ApoE的分级和总水平（n=3）。凝胶源数据见补充图2。数据用平均值±SEM表示，用Tukey的post-hoc进行单向方差分析统计分析采用双侧检验*p＜0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
扩展数据图4
扩展数据图4。ApoE4促进早期病理性tau从轴突重新分布到细胞体
一3月龄TE小鼠海马AT8染色。齿状回（DG）颗粒细胞体周围有点状轮廓。b条，DG细胞体内AT8覆盖区域的定量区域（TE2:n=16、TE3:n=10、TE4:n=10，TEKO:n=14）。数据表示为平均值±SEM，单因素方差分析Tukey的事后测试（双面）*p＜0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
扩展数据图5
扩展数据图5。3个月龄TE小鼠或9个月龄非金转基因小鼠的小胶质细胞基因表达无变化或变化极小，尽管9个月大的TE小鼠发生了显著变化
一、小胶质细胞基因表达的纳米线分析在9月龄TE4小鼠和9月龄非金转基因小鼠中（n=5-6）。层次基因聚类生成的热图基于基因型（水平：534个小胶质细胞基因，垂直：个体小鼠样本）b条，来自簇1或簇2的基因的Z得分类别。c（c）、小胶质细胞基因表达的纳米线分析9月龄和3月龄TE小鼠（n=5-6）。d日,簇1或簇2类别基因的Z评分。克鲁斯卡尔·沃利斯试验使用Dunn的多重比较测试进行统计分析。数据以平均值±SEM表示。*p＜0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
扩展数据图6
扩展数据图6。P-tau染色模式与不同的小胶质细胞激活谱相关
一，通过层次化基因聚类生成的热图基于9月龄TE小鼠的p-tau染色类型（n=7–8）。b。主成分分析（PCA）p-tau染色类型的小胶质细胞基因表达谱。c。簇1或簇2类别基因的Z评分。Kruskal-Wallis检验与Dunn的多重比较检验进行统计分析。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
扩展数据图7
扩展数据图7。9月龄非金转基因小鼠A1星形细胞基因未激活
一活化星形细胞基因的微流控RT-qPCR在9月龄TE4小鼠和9月龄非金转基因WT和人类ApoE中KI小鼠（n=5）。A1特异性：仅由LPS激活的基因；A2特异性：基因仅由缺血激活；PAN反应：基因激活LPS或缺血。
扩展数据图8
扩展数据图8。拥有ε4等位基因加速AD患者的疾病进展
592个脑脊液生物标记物队列中的疾病进展率得到证实来自两项不同纵向研究的症状性AD患者华盛顿奈特阿尔茨海默病研究中心（ADRC）大学和阿尔茨海默病神经成像计划（ADNI）。根据框的临床痴呆分级总和生成的数据（CDR-SB）得分。ε4等位基因的显著拥有加速疾病进展（p=0.02），有一个ε4等位基因进展率提高14%和两个ε4等位基因与非携带者相比，该比率提高了23%（线性混合模型，双面）。
扩展数据图9
扩展数据图9。假设的示意性总结
一，ApoE对神经元死亡至关重要病理状况。随着病理性τ堆积ApoE，尤其是ApoE4，使神经元更容易受到变性，而ApoE的缺失可以保护神经元免受死亡，导致神经退化（E4>E3≈E2>>EKO）。退化神经元进一步诱导神经炎症，由于其固有的较高先天免疫反应性，从而加剧此外，神经变性。神经炎症可能同时影响tau病理学，结果在各种p-tau染色类型中神经变性。b条，ApoE影响τ的发病机制，导致在不同的p-tau模式中，可能具有不同的神经毒性（类型4>类型3≈类型2>类型1），导致不同神经元死亡水平与脑萎缩（E4>E3≈E2>>EKO）。神经炎症伴随的神经退行性变反过来会加剧神经元死亡。c（c），ApoE影响tau发病机制，导致可能具有不同诱导能力的p-tau模式神经炎症（4型>3型≈2型>1型）最终导致不同程度的神经退化。
图1
图1。ApoE4加重P301S小鼠的神经退行性变，而ApoE的基因消融与较少的损伤相关
一、9个月大野生型（WT）和TE小鼠的代表性图像苏丹红染色的脑切片b条，卷梨状/内嗅皮质、海马和后侧脑室9-10个月大的WT和TE小鼠（WT:n=8，TE2:n=22，TE3:n=21，TE4:n=32，TEKO:n=30）。c、 d日,9月龄WT和WT齿状回颗粒细胞层厚度甲酚紫染色的TE小鼠（WT:n=7，TE2:n=14，TE3:n=11，TE4：n=17，TEKO：n=16）。e（电子）,颗粒层厚度与海马体积的相关性，n=62生物学上独立的动物。皮尔逊相关分析，第页2=0.6，p<0.0001（双面）。数据表示为平均值±SEM，Tukey事后检验（双侧）的单向方差分析为用于除Kruskal-Wallis检验和Dunn检验外的所有统计分析对左室后部容积进行多重比较试验（双侧）分析*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。Ent：内鼻皮层，Piri：梨状皮质，LV：侧脑室，DG：齿状回。
图2
图2。ApoE基因型差异调节tau病理
一用酶联免疫吸附法（ELISA）测定TE小鼠RAB中人P301S tau水平，在两个时间点：3个月（WT：n=2，TE2:n=15，TE3:n=11，TE4:n=12，TEKO:n=16）和9个月（WT:n=5，TE2:n=14，TE3:n=11，TE4：n=17，TEKO：n=38）。b条、P-tau（AT8）覆盖3月龄和9月龄TE小鼠海马区。c（c），P-tau染色模式与脑萎缩程度，n=104只生物独立动物。a–c，数据表示为平均值±SEM，单向用Tukey的事后检验进行方差分析（双侧）。d日，四个根据海马染色确定了不同的p-tau染色模式特征。1型具有强烈的苔藓纤维染色和弥散的细胞体齿状回颗粒细胞层和CA1锥体细胞层染色；2型细胞主要在齿状回颗粒细胞和CA3锥体细胞，但也有稀疏的CA1区染色；3型主要在神经膜上染色CA区域放射状层，树突清晰染色锥体神经元和神经元胞体中仅有部分染色；类型4具有与其他染色模式不同，整个海马体呈密集染色4染色呈碎片状、点状和粒状.电子，分配9-10个月龄TE小鼠的四种p-tau染色类型（TE2:n=22，TE3:n=21，TE4:n=32，TEKO:n=38）。Fisher精确测试，双侧（所有组：p=3.4e-05，TE2 vs。TEKO:p=0.021，TE3与TEKO:p=0.0016，TE4与TEKO:p=1.9e-07）*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图3
图3。ApoE强烈调节小胶质细胞活化
一，人ApoE KI小鼠培养的小胶质细胞（E2，E3，E4）用1ng/ml LPS处理大脑24小时，培养基中细胞因子水平为通过ELISA（2个孔/基因型）测量，实验重复3次。b条，小胶质细胞基因表达的纳米串分析9个月大的TE或EKI/EKO小鼠海马体。分层生成的热图基于基因型的基因聚类（水平：534个小胶质细胞基因，垂直：小鼠个体样本；TE3、TE4、TEKO、E3:n=6、E4:n=4、EKO：n=3）。c（c），顶部差异表达的cluster1和cluster2来自热图的基因（标准：TE4与TEKO的折叠变化，从高到低，p值<0.01; TE4与TE3的折叠变化>1.2）。簇1：促炎症基因，簇2：细胞功能相关基因（代谢、信号、，转录等），簇3：稳态基因/检测以下的基因。d日所有组的聚类1或聚类2基因的z评分。Kruskal-Wallis检验与Dunn多重比较检验（双侧）进行统计分析。e、 （f），CD68（激活9月龄TE小鼠（WT:n=5，TE2:n=14，TE3:n=11，TE4:n=17，TEKO:n=10）。数据表示为平均值±SEM，使用Tukey的帖子进行单向方差分析特设测试，双面*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图4
图4。ApoE4在体外可导致强烈的星形细胞活化并促进神经元死亡，而ApoE的缺失则导致星形细胞活化减少并保持神经元完整性
一9个月内活化星形细胞基因的微流控RT-qPCR老TE4小鼠（n=8）、TEKO小鼠（n=8）和3个月大的TE4小鼠（n=6）。A1特异性：仅由LPS激活的基因；A2特异性：基因仅通过缺血激活；PAN反应：由LPS或缺血。b条9月龄TE小鼠（WT:n=5，TE2：n=14，TE3：n=11，TE4 n=17，TEKO：n=10）。c（c）GFAP IR覆盖面积的量化。d日,GFAP IR与脑容量的相关性。生物学上N=57独立动物。皮尔逊相关分析（双面）。海马：第页2=0.66，p<0.0001；梨状皮层：第页2=0.68，p<0.0001。e（电子），Western blot用于9月龄TE小鼠的GFAP（n=3）。凝胶源数据见补充图1。（f），感染初级WT神经元的代表性图像AAV2/8-突触蛋白-P301S人tau与混合胶质细胞共培养（80-90%星形胶质细胞，10-20%小胶质细胞）衍生从人类ApoE KI（E2，E3，E4）和ApoE KO小鼠大脑中提取3周。实验复制5次克神经元数量和面积的量化共同培养神经元的MAP2 IR覆盖（4孔/基因型，8个随机图像取/井）。小时共培养基中TNFα水平用ELISA测定。我，初级WT神经元的代表性图像感染10μg/ml处理的AAV2/8-突触蛋白-P301S人tau重组人ApoE 3周。实验重复了两次。j个,MAP2染色定量神经元数量和覆盖面积ApoE处理的神经元（3个孔/处理，8个随机图像/孔）。表示的数据作为平均值±SEM，使用Tukey的事后检验进行单向方差分析，双面*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
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