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.2017年9月28日:6:e21992。
doi:10.7554/eLife.21992。

神经酰胺合成酶2b基因介导斑马鱼胚胎发生期间鞘氨醇水平的基因组传感和调节

附属公司

神经酰胺合成酶2b基因介导斑马鱼胚胎发生期间鞘氨醇水平的基因组传感和调节

凯伦·门德尔森等。 埃利夫. .

摘要

鞘氨醇激酶(Sphk1和Sphk2)通过鞘氨醇磷酸化生成鞘氨醇-1-磷酸(S1P)。我们证明了这一点sphk2型母体合子突变斑马鱼胚胎(sphk2型MZ公司)显示早期发育表型,包括表皮生长延迟、S1P水平降低、鞘氨醇水平升高和对鞘氨醇毒性的抵抗。这个sphk2型MZ公司胚胎还显著增加了编码神经酰胺合成酶2b(Cers2b)的母体转录物水平,以及sphk2型MZ公司胚胎表现鞘氨醇毒性。的上游区域cers2b型启动子支持报告基因在sphk2型MZ公司胚胎与野生型胚胎相比。此外,Cers2b蛋白本身的异位表达降低了启动子的活性,外源性鞘氨醇可以缓解这种抑制。因此sphk2型MZ公司基因组识别鞘氨醇激酶活性的缺乏并上调cers2b作为鞘氨醇周转的补救途径。Cers2b还可以作为鞘磷脂反应因子,调节至少部分反馈调节机制。

关键词:生物化学;发育生物学;外延;原肠胚形成;遗传学;卵子发生;鞘磷脂;干细胞;斑马鱼。

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没有宣布竞争利益。

数字

图1。
图1sphk2型MZ公司胚胎发育延迟与鞘氨醇水平升高有关。
(A、 B类)与受精后7或8小时观察到的时间匹配的代表性野生型胚胎相比sphk2型MZ公司胚胎(C、 D类)在外胚层发育过程中显示发育延迟,用箭头表示胚层前缘。(E、 F类)用3μM鞘氨醇(sph)处理2 hpf的野生型胚胎也同样延迟发育。用G)C8神经酰胺(20μM)治疗野生型胚胎(H(H))S1P(20μM),或()N-乙酰-D-鞘氨醇(20μM)对表面活性物质无不良影响。A-I显示了具有代表性的胚胎,在3个独立实验中,每个实验至少有25个胚胎。(J)基于6 hpf时的脂质谱分析sphk2型MZ公司胚胎缺乏S1P(Sph-1P),鞘氨醇和(K(K))与时间匹配的野生型胚胎相比,总的长链神经酰胺。对于J和K,结果是三个独立实验的平均值,每个实验共用50个胚胎;误差条表示平均值的标准误差。
图2。
图2过量鞘氨醇会导致原肠胚发育缺陷和胚胎死亡,在sphk2型MZ公司突变。
(A类)在DMSO中培养的胚胎在7 hpf下表皮生长期间,发育中的胚层显示出正常的卵黄覆盖率。(B类)用5μM D处理野生型胚胎-红的-鞘氨醇(活性天然异构体)或(C类)5μM升-红的-鞘氨醇(非活性异构体)导致胚胎在外胚层发育过程中停滞,卵黄膜破裂,胚胎无法完成原肠胚形成。用(D类)5μM D-半乳糖基-1’-D-红的-鞘氨醇(精氨酸)(E类)10μM二甲基鞘氨醇(DMS),以及(F类)20μM升-苏式-二氢鞘氨醇(Safingol)。用两种鞘氨醇激酶化学抑制剂治疗野生型胚胎(G公司)SKI(10μM)或(H(H))BT-190(3μM)重现了灾难性胚胎表型。()用5μM鞘氨醇处理的野生型(WT)胚胎中,大多数(144/173,83%)在原肠胚形成期间表现出致死表型,而大多数(175/176,99%)的野生型胚胎在原肠胎形成期间表现为致死表型sphk2型MZ公司用5μM鞘氨醇处理的胚胎完成了原肠胚形成和早期发育,仅随后显示了在sphk2型MZ公司胚胎,没有额外的缺陷。对照胚胎在DMSO载体中培养(1%)。所示为至少三个独立实验的代表性胚胎,n表示。
图3。
图3过度鞘氨醇破坏肌动蛋白和微管组织,减少结合E-钙粘蛋白。
(A类)在原肠胚形成期间,肌动蛋白在植物极聚集,如在约50%外周血(5.3 hpf)的DMSO处理对照胚胎中的阴茎倍体染色所示。Phalloidin染色显示,用(B类)5μM鞘氨醇(C类)3μM BT-190,或(D类)10μM SKI(用星号表示)。对于A-D,EVL的平均进展百分比表示为从极点测量的每种情况下5个胚胎的代表性集合。(E–H(E–H))在更高的放大倍数下显示,与DMSO处理的对照相比,F-肌动蛋白也在处理的胚胎中的包膜细胞的细胞质中积累。在外延过程中,在YSL处DMSO处理的胚胎中可以看到两个垂直的微管层()在YCL中(L(左)). 用α-微管蛋白染色显示,在用(J)5μM鞘氨醇或(K(K))3μM BT-190以及(M、 N个)YCL的某些区域(用星号表示)和其他完全没有微管的区域中的微管聚集。用括号表示(I-K公司)与深层细胞层相比,EVL的进展似乎更为延迟。(O(运行))DMSO处理的胚胎显示EVL细胞的结合E-钙粘蛋白染色。(P、 问)用5μM鞘氨醇或3μM BT-190处理的胚胎中EVL细胞的连接E-cadherin染色减少,EVL细胞质内的染色积聚。对于所有小组,显示了具有代表性的胚胎,n至少是来自三个独立实验的100个。
图4。
图4sphk2型MZ公司胚胎表现出惊人的高水平cers2b抄本。
(A类)神经酰胺合成酶和神经酰胺酶基因的qRT-PCR分析表明cers2bsphk2型MZ公司胚胎(p=0.019)与野生型胚胎(2hpf)比较。(B类)代表性野生型或(C类)sphk2型MZ公司注射5.3ngα后的胚胎cers2b翻译阻断吗啉(MO)(D类)胚胎来自sphk2型MZ公司; cers2b+/-增加损失。对于野生型胚胎,155/161(96%)完成了正常的原肠胚形成、外胚层发育,在2 dpf时表现正常。注入后sphk2型MZ公司4个单独实验的胚胎中,60/288个或21%的胚胎再现了早期原肠胚死亡表型(p=0.0154)。相应地,43/190或23%的胚胎来自杂交sphk2型MZ公司; cers2b+/-成鱼通过9hpf重演早期原肠胚形成致死表型。(E类)Sphk2变形胚胎无法上调cers2b成绩单和(F类)与注射对照吗啉酸的人相比,神经酰胺水平没有变化。(G公司)在培养基中暴露于5μM鞘氨醇的胚胎同样无法上调cers2b转录水平和(H(H))神经酰胺积累无差异。()母体沉积胚胎中鞘氨醇(Sph)或S1P(Sph-1P)水平无显著差异Sphk2公司,符合正常发展。在6 hpf条件下采集胚胎进行qPCR和脂质测量。所有实验重复至少三次,结果相同。
图5。
图5cers2b启动子在Sphk2公司MZ公司胚胎与野生型胚胎相比,受Cers2b抑制,依赖于HOX结构域。
(A类)显示了来自三个独立实验的相对荧光素酶活性,比较了由cers2b发起人海鳃荧光素酶(RL),来源于联合注射海鳃萤光素酶RNA。在sphk2型MZ公司胚胎与野生型胚胎相比,p<0.0001。为了证明这反映了cers2b类似地,比较了上游序列逐渐减少的较短启动子片段。大多数启动子活性位于上游400 bp,将该序列转移到异源(最小SV40)启动子足以将反应转移到sphk2型MZ公司胚胎。(B类)在HEK293T哺乳动物细胞中进行了类似的荧光素酶报告分析。Cers2b的异位表达导致cers2b启动子调控的报告子与空表达载体控制相比。这种抑制在用10 mM鞘氨醇处理的细胞中得到缓解,这不会影响报告者的基础水平(空载体+鞘氨醇)。抑制也被预测破坏同源盒(HOX)结构域功能的突变所消除,而催化(LAG)结构域的突变不会影响蛋白质的抑制能力。(C类)当Cers2b在HEK293T细胞中过度表达时,神经酰胺水平因其催化活性而增加,该催化活性不受同源异型盒(HOX)突变的影响,但完全被催化(LAG)域突变破坏。这表明启动子上的抑制活性与Cers2的催化活性无关。所有结果均来自三个独立实验的平均值;条形图表示平均值的标准误差。统计显著性由单向方差分析得出,用*(p<0.05)、**(p<0.01)、***(p<0.001)表示。N.S.表示不显著。
图6。
图6:神经鞘氨醇水平的增加改变了Cers2蛋白的亚细胞定位。
将转染Cers2-GFP表达质粒的HEK293T细胞在培养基中暴露于10μM鞘氨醇6小时后进行检测。(A类)用鞘氨醇(Sph)处理的细胞显示Cers2b-GFP(绿色)的亚细胞重定位,核区域(DAPI,蓝色)内有更多重叠,如z堆叠(侧板)所示。(B–C)用Cers2、GAPDH(作为细胞质蛋白对照)、TBP(作为核蛋白对照)或LaminB1(作为核膜相关蛋白对照)特异性抗体对裂解产物进行Western blotting分析。(B类)亚细胞分馏为细胞质(Cyto)和核(Nuc)裂解物证实了经鞘氨醇处理的细胞中Cers2的核结合增加。(C类)使用核膜分离试剂盒进行分馏表明,Cers2在核膜组分中最富集。
图7。
图7卵子发生期间的转录变化sphk2型MZ公司对鞘氨醇积累的抵抗力。
从野生型和sphk2型-/-雌性鱼类表演(A类)突变卵母细胞中鞘氨醇(Sph)水平的增加与S1P(Sph-1P)缺失相关(B类)总神经酰胺水平没有差异。(C类)卵母细胞来源于sphk2型-/-卵母细胞显示出显著的上调cers2b转录本,如原位杂交后的图像所示。请注意,野生型卵母细胞中的信号相当于使用sense-strend控制探针进行背景染色。(D类)相应地,胚胎来源于sphk2型-/-与野生型雌性(左侧)相比,雌性(右侧)在含有5 uM鞘氨醇的培养基中培养时,对鞘氨醇积累表现出相对耐受性。对于(A、 B类) . 结果是三个独立实验的平均值,每次测量至少使用50个胚胎。对于(C、 D类),有代表性的胚胎显示,n>25,来自至少三个独立实验。

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