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.2017年9月27日；13（9）：e1006635。
doi:10.1371/journal.ppat.1006635。 eCollection 2017年9月。

流感病毒差异激活mTORC1和mTORC2信号以最大限度地提高后期复制

莎朗·库斯·杜尔科普 1, 王娟（Juan Wang） 1, 伊格纳西奥·梅纳 2 三, 克里斯·怀特 2, 乔治·梅特雷维 2, 拉马诺夫兰·萨科蒂维尔 1, 米盖尔·马塔 1, 拉奎尔·穆尼奥斯·莫雷诺 2, 向晨 4, 弗洛里安·克拉默 2, 迈克尔·S·戴蒙德 5, Zhijian J Chen先生 4 6, 阿道夫·加西亚·萨斯特雷 2 三 7, Beatriz M A Fontoura公司 1
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流感病毒差异激活mTORC1和mTORC2信号以最大限度地提高后期复制

莎朗·库斯·杜尔科普等。 公共科学图书馆-病理学. .

摘要

甲型流感病毒篡夺宿主信号因子来调节其复制。mTOR就是一个例子，它是蛋白质合成、生长和运动的细胞调节器。虽然mTORC1在病毒感染中的作用已被研究，但在流感病毒感染期间诱导mTORC1激活的机制和mTORC1调节的底物尚未确定。此外，mTORC2在流感病毒感染中的作用尚不清楚。在这里，我们显示mTORC2和PDPK1在流感病毒感染时差异磷酸化AKT。流感病毒激活mTORC1需要PDPK1介导AKT在不同位点的磷酸化。另一方面，病毒NS1蛋白通过mTORC2促进AKT在不同位置的磷酸化，这是一种对mTORC1刺激不必要但已知可调节凋亡的活性。流感病毒HA蛋白和病毒M2蛋白下调mTORC1抑制剂REDD1可促进mTORC2活性。在缺乏mTORC2组分Rictor的细胞中进行的系统磷酸化蛋白质组学分析显示，在感染期间，mTORC1依赖性底物受到调节。确定了调节mTORC1或受mTORC1调节的途径的成员，包括翻译机制的成分，这些成分一旦被激活就可以促进翻译。mTORC1激活支持病毒蛋白的表达和复制。由于mTORC1的激活在病毒生命周期的中途是最佳的，因此观察到的对病毒蛋白表达的影响可能支持流感病毒复制的后期阶段，即受感染的细胞承受巨大压力。

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图1
图1。在流感病毒感染期间，PDPK1磷酸化AKT以促进mTORC1激活。
(A类)PI3K/AKT途径和mTORC1激活的示意图。实线代表流感病毒对信号通路的调节。虚线表示这些途径中的知识差距，带问号的方框表示未知的调节因素。(B类)HCT116型阿克特1/2+/+和阿克特1/2-/-在2个PFU/细胞的MOI下感染WSN 6小时。用针对所述蛋白质的抗体对细胞裂解物进行免疫印迹分析。(C类)里克托+/+和里克托-/-MEF处理方式如下B类除感染10小时外。(D类)Tbk1型+/+和Tbk1型-/-MEFs+/-1μM BX795按照B类. (E类)HCT116型Pdpk1型+/+和Pdpk1型-/-按中的方式处理B类数据代表三个独立实验。中的虚线C类表示同一免疫印迹膜上遗漏了不必要的通道。M2、M1和NS1：病毒蛋白；宿主蛋白：β-actin、Rictor、TBK1、PPDPK1、总蛋白和磷酸化S6K、AKT和4E-BP1。总S6K、β-肌动蛋白和总AKT作为负载对照。
图2
图2。流感病毒需要病毒复制才能独立于NS1激活mTORC1。
(A类,B类)Vero细胞被感染(A类)WSN或(B类)PR8野生型或突变型病毒在2个PFU/细胞的MOI中缺失NS1 6小时(C类,D类)HCT116型阿克特1/2+/+和阿克特1/2-/-感染WSNΔNS1或WSN，MOI为5 PFU/细胞，持续10h。(E类)将WSN或UV-inactivated WSN以2 PFU/cell的MOI感染A549细胞6h。(F类)小牛队+/+和小牛队-/-或(G公司)伊菲特m3+/+和伊菲特m3-/-以2pFU/细胞的MOI用WSN感染MEFs 6小时。进行免疫印迹分析以检测病毒蛋白（NS1、HA、NP和M1）和宿主蛋白（β-肌动蛋白、MAVS、IFITM3以及总的和磷酸化的S6K、AKT和4E-BP1）。β-actin和总S6K用作负荷控制。S6K/p-S6K杂交中的上带为p85 S6K，而下带为p70 S6K。数据是三个独立实验的代表。
图3
图3。病毒蛋白HA促进mTORC1激活。
(A类)用靶向病毒mRNAs的siRNAs（每个池三个）转染A549细胞，然后在2 PFU/细胞的MOI下感染6小时。对描述的蛋白质进行免疫印迹分析。(B类)用控制质粒或编码NP的质粒、聚合酶亚基（PA、PB1和PB2）和荧光素酶报告基因转染细胞，以测定流感病毒启动子活性（小基因组分析），从而测定重组聚合酶复合体的活性。使用针对所述蛋白的抗体进行荧光素酶分析和免疫印迹分析。(C类)用对照质粒或编码HA或NA的质粒转染MDCK细胞，在2 PFU/cell的MOI下模拟感染或感染WSN 6h。使用针对所述蛋白质的抗体进行免疫印迹分析。数据是三个独立实验的代表。
图4
图4。流感病毒下调REDD1以促进mTORC1活性。
(A-C公司)将WSN感染A549细胞，感染时间为每细胞2个PFU。细胞提取物(A类)western blot分析检测所描述的蛋白质并按S5图或(B类)纯化RNA进行qRT-PCR以测定REDD1 mRNA水平。qRT-PCR显示了平均值和标准偏差，n个=4个独立实验，一式三份**第页<0.000004，学生t吨-测试。(C类)用靶向病毒mRNA的siRNA（每个三个）转染A549细胞，然后以2pFU/细胞的MOI感染7小时。进行免疫印迹分析以检测描述的蛋白质，n个=3。(D类)用编码所示病毒蛋白的质粒转染A549细胞。在转染后48小时，纯化总RNA，并通过qRT-PCR测定REDD1 mRNA水平，如B类。中的底部面板D类显示了所述病毒蛋白和/或微基因组作为对照转染后的病毒聚合酶活性。用qRT-PCR测定小基因组mRNA。在用编码病毒聚合酶的整套质粒转染的细胞中，我们检测到由pol I直接从质粒转录的小基因组RNA，以及由流感蛋白扩增的小基因组RNA，表明蛋白质活性。在除PA外的相同质粒转染的细胞中，我们只检测到由pol I直接从质粒转录的小基因组RNA，平均值设置为1。转染所有质粒后，小基因组RNA水平较高(n个= 3). (E、 F类)用编码M2蛋白的质粒对照质粒转染MDCK细胞。在E中，纯化RNA进行qRT-PCR，以测定REDD1 mRNA水平，如B类,n个=3，***p<0.001。在F、，对细胞提取物进行蛋白质印迹分析，以检测所描述的蛋白质(n个= 3). (G公司)在感染之前和感染期间，用载体或1μg/ml四环素处理U2OS-REDD1细胞2小时，以诱导REDD1表达。细胞在2个PFU/细胞的MOI下感染6 h。进行免疫印迹分析以检测所述蛋白。Total S6K用作加载控制。S6K/p-S6K斑点中的上带为p85 S6K，而下带为p70 S6K(n个= 3).
图5
图5。mTORC1激活促进病毒感染。
(A类)A549细胞在2 PFU/细胞的MOI下用WSN感染1 h，然后用250 nM Torin1或DMSO再处理9 h，然后进行免疫印迹分析。(B类)在所示浓度的Torin1或DMSO存在下，在0.01 PFU/细胞的MOI下用WSN感染A549细胞16小时。通过菌斑试验测量病毒滴度，得出每毫升的菌斑形成单位（PFU/mL，标绘为相对于DMSO对照的感染百分比）。使用MTT分析在所示浓度下评估细胞存活率。计算了以下参数：CC50>500毫微米；集成电路50=0.46nM；且SI>1087。(C类)实验按中所示进行B类但以13.7μM雷帕霉素或二甲基亚砜作为对照。显示了平均值和标准误差（SEM）。n个=3，**p<0.01。(D类)里克托+/+或里克托-/-MEF在2 PFU/细胞的MOI下感染WSN 6 h，并在感染后1 h用250 nM Torin1或DMSO治疗。进行免疫印迹分析以检测病毒蛋白（HA、NP、PA、PB1、PB2、NS1、M1、M2和NA）和宿主蛋白（β-肌动蛋白、Rictor、总的和磷酸化的S6K和4E-BP1）。β-actin和S6K用作负荷控制。S6K/p-S6K杂交中的上带为p85 S6K，而下带为p70 S6K。(E类)里克托+/+或里克托-/-MEF以0.01的MOI感染WSN 24小时和48小时。通过菌斑试验测定病毒滴度，得出每毫升形成菌斑的单位（PFU/ml）。显示了平均值和标准偏差（SD），n个=3，**p<0.01，**p<0.05。
图6
图6。流感病毒感染期间发现的mTORC1依赖性磷酸化。
(A类)里克托-/-将MEFs以2PFU/细胞的MOI用WSN感染7小时，并用Torin1或DMSO处理。对细胞进行磷酸肽富集和质谱分析。显示的数据是WSN感染的结果里克托-/-Torin1治疗的MEF与WSN感染的MEF的比较里克托-/-用二甲基亚砜处理的MEF。该表显示了Torin1处理与DMSO处理感染细胞中的蛋白质名称和ID、氨基酸（aa）磷酸化的位置以及磷酸肽读数的比率（>和<1.5倍或更多）。下划线+粗体点击描述了模拟感染中识别的蛋白质的mTORC1依赖性磷酸化里克托-/-MEFs-/+Torin1（S1表）。与其他研究中已知的蛋白质点击重叠的蛋白质点击显示在表的底部。(B类)细胞裂解物来自里克托-/-对MEF进行免疫印迹分析，以确认Torin1抑制mTORC1，如p-S6K减少所示，并通过NS1蛋白水平评估流感病毒蛋白表达。(C类)细胞裂解物来自里克托-/-MEF接受免疫印迹分析，以显示A类p-eIF4B（S422），由Torin 1下调，是未感染和感染细胞中的mTORC1底物。(D类)对图6A中列出的所有蛋白质进行基因集富集分析（GSEA）。前五条通路显示了通路中总基因（K）与磷酸蛋白质组学筛查中确定的重叠基因（K）之间的重叠百分比。第页-统计显著性值和问-显示了错误发现率（FDR）的值。
图7
图7。流感病毒在病毒生命周期中途激活mTOR的模型示意图。
病毒蛋白HA和病毒复制通过PDPK1介导的T308处AKT磷酸化促进mTORC1激活。此外，病毒M2蛋白下调REDD1可放大或支持AKT下游的mTORC1激活。NS1通过mTORC2促进S473的AKT磷酸化，该过程已知可调节细胞凋亡。AKT磷酸化差异决定下游效应。
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