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.2017年9月26日；14(1):192.
doi:10.1186/s12974-017-0967-6。

星形胶质细胞α7烟碱型乙酰胆碱受体的抗炎作用通过抑制NF-κB通路和激活Nrf2通路介导

希拉尔·帕特尔 1 2, 杰西卡·麦金泰尔 三, 莎拉·瑞恩 三, 安通·杜纳 4, 拉尔夫·洛林 5
附属公司

星形胶质细胞α7烟碱型乙酰胆碱受体的抗炎作用通过抑制NF-κB通路和激活Nrf2通路介导

希拉尔·帕特尔等。 神经炎症杂志. .

摘要

背景：α7烟碱乙酰胆碱受体（nAChRs）广泛分布于中枢神经系统，据报道具有神经保护作用。α7 nAChR在星形胶质细胞上表达，星形胶质细胞是几种神经退行性疾病中神经炎症和氧化应激的关键调节因子。然而，星形胶质细胞α7 nAChRs的抗炎和抗氧化特性尚未得到很好的研究。因此，我们评估了星形胶质细胞α7 nAChR活化在神经炎症中的作用。

方法：在原代星形胶质细胞培养物中使用脂多糖（LPS）在体外神经炎症小鼠模型中评估α7nAChR激活的抗炎和抗氧化作用。采用ELISA、基因表达分析、免疫荧光和western blotting评估α7nAChR对NF-κB通路的抗炎作用。通过定量PCR和western blotting检测α7nAChR激活对典型Nrf2靶基因表达谱的抗氧化作用。使用Nrf2敲除星形胶质细胞评估Nrf2途径在α7nAChR介导的抗炎反应中的作用。在脂多糖（LPS）注射NF-κB荧光素酶报告小鼠模型中，用α7 nAChR激动剂治疗后，评估脑体外NF-κ子B荧光素酶信号。

结果：经α7nAChR部分激动剂（GTS21）处理的星形胶质细胞显示出明显减少LPS介导的炎性细胞因子分泌，这种作用被α7nAchR拮抗剂甲基狼毒碱（MLA）和用短发夹RNA敲低α7nA2hR表达所逆转，α7nAChR激活阻断LPS介导的NF-κB核转位，表明所观察到的抗炎作用可能是通过抑制NFκB途径介导的。GTS21治疗也上调了典型的Nrf2抗氧化基因和蛋白质，表明星形胶质细胞中α7 nAChR的抗氧化特性。使用星形胶质细胞条件培养基方法，我们证明了用GTS21预处理星形胶质细胞时，神经元凋亡减少。最后，在NF-κB荧光素酶报告小鼠中使用LPS的体内神经炎症模型中，我们证明GTS21治疗可以降低脑组织中LPS诱导的NF-kb活性和促炎细胞因子。

结论：我们的结果表明，激活星形胶质细胞α7 nAChRs可能通过减少炎症和氧化应激在神经保护中发挥作用，因此可能对神经退行性疾病的疾病修饰治疗具有治疗意义。

关键词：星形胶质细胞；NF-κB通路；Nrf2途径；α7烟碱乙酰胆碱受体。

PubMed免责声明

利益冲突声明

道德批准和参与同意

所有涉及动物的程序均由生物研究所动物护理和使用委员会（IACUC）批准，该委员会由国际实验动物护理评估和认证协会（Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International）认证。

出版同意书

不适用。

竞争性利益

本研究与Biogen合作，部分满足了Patel博士在马萨诸塞州波士顿东北大学的博士课程要求。Dunah博士、Ryan女士和McIntyre女士是Biogen的员工。Patel博士目前是Abbvie的全职员工。作者声明，他们没有相互竞争的利益。

出版商备注

Springer Nature在公布的地图和机构关联中的管辖权主张方面保持中立。

数字

图1
图1
神经炎症体外模型的特征和小鼠星形胶质细胞中α7nAchRs的表达。一这些是小鼠星形胶质细胞的代表性图像，使用Cellomics ArrayScan XTI高含量分析系统在× 放大20倍。在每个场中，捕获两个通道以成像细胞核（DAPI）和星形胶质细胞标记物（GFAP）。ArrayScan靶点激活生物应用程序用于处理和分析图像，以使用DAPI将GFAP阳性细胞量化为井内总细胞计数的百分比。这一比例超过90%。b条LPS（60 ng/ml）治疗3 h后，星形胶质细胞中NF-κB p65亚单位的核移位增加，作为急性炎症期的标志。c（c）LPS（60ng/ml）处理24小时导致星形胶质细胞中NF-κB激活下游的促炎细胞因子TNF和IL-6显著增加*第页与未治疗相比<0.05(t吨测试）。误差条代表SD(n个 = 4).d日与对照细胞相比，用LPS（60 ng/ml）刺激星形胶质细胞24小时后，细胞进程显著增加。e（电子）在培养的星形胶质细胞中观察到α7nAChR亚单位mRNA的表达（三次重复）。（f）在星形胶质细胞中观察到荧光标记的α-银环蛇毒素的结合。用200μm尼古丁（α7nAchR激动剂）预处理，显著抑制荧光标记的α-银杏毒素的结合，表现为这些细胞中α7nAChR的荧光确认表达减少
图2
图2
α7nAchR激活降低了LPS介导的星形胶质细胞促炎细胞因子的分泌。一与单独治疗24小时的LPS相比，GTS21（α7nAchR激动剂）预处理1小时导致IL-6和TNF-α分泌的剂量依赖性降低*第页与LPS（60 ng/ml）治疗组相比<0.05（单因素方差分析，使用Dunnett检验对多重比较进行调整）。误差条代表SD(n个 = 4).b条用1μmα7nAchR拮抗剂（MLA）预处理培养的星形胶质细胞1h，通过LPS处理24 h后星形胶质细胞分泌促炎细胞因子TNF-α和IL-6来测定20μm GTS21的抗炎反应被阻断*第页与LPS 60 ng/ml治疗相比<0.05，# 第页与单独的激动剂治疗相比，<0.05（均使用单向方差分析，并使用Tukey检验调整多重比较）。误差条代表SD(n个 = 4).c（c）用lent短发夹RNA敲低星形胶质细胞中α7nAchR的表达~ 75%的基因敲除，显著阻断经LPS处理24小时的星形胶质细胞中GTS21（30μm）的抗炎反应。误差条代表SD(n个 = 2)
图3
图3
α7nAchR激活导致NF-κB信号通路的抑制和星形胶质细胞增生。一用GTS21（15和30μm）预处理30分钟后，LPS（60 ng/ml）处理的星形胶质细胞中IκBα磷酸化形式减少。b条用LPS（60 ng/ml）处理星形胶质细胞3 h可引起NF-κB的强烈核转位，而用α7 nAchR激动剂GTS21（30μm）预处理1 h可显著降低NFκB核转位*第页<0.05（单因素方差分析，使用Dunnett检验对单LPS组和GTS21+LPS组的比较进行多重比较调整，作为单LPS的百分比）。误差条代表SD(n个=6口井，50个油田/口井）。c（c）GTS21（30μm）处理减少了LPS（60 ng/ml，持续24小时）激活的星形胶质细胞中的突起数量，表明反应性星形胶质细胞增生减少。d日用7.5、15和30μm的GTS21预处理1 h后，LPS（60 ng/ml，72 h）诱导的亚硝酸盐水平呈剂量依赖性降低，进一步证实了α7 nAchR激活的抗炎特性*第页与对照组相比<0.05，# 第页与LPS、60 ng/ml治疗组相比，<0.05（均使用单向方差分析，并使用Tukey检验调整多重比较）。误差条代表SD(n个=6）
图4
图4
α7nAchR激活降低了LPS诱导的星形胶质细胞炎症基因。一使用覆盖632个炎症基因的TaqMan®OpenArray®小鼠炎症面板测量LPS介导的炎症基因，并在火山图上绘制变化，在火山图上绘制对数倍变化x个-校正的轴和对数第页上的值年-轴。红色垂直线表示褶皱变化的边界。绿色圆点表示至少低1.5倍的表达，红色圆点表示表达至少高1.5倍（在第页 < 0.05). 在水平线下方绘制的灰色圆点表示无统计学意义的变化。用GTS21（30μm）预处理星形胶质细胞1 h，然后用LPS（60 ng/ml）处理24 h，导致炎症基因上调的数量显著减少（下部面板中的红点较少），表明α7 nAchR激活具有强大的抗炎作用。b条使用通用基因集富集（GAGE）软件包进行基因集富集分析基于GTS21治疗的214个差异表达的炎症基因，在R Bioconductor中确定GTS21加LPS治疗样品中炎症基因下调丰富的KEGG通路，与单独LPS治疗的样品相比。该图显示了NF-κB信号通路，GTS21治疗显著下调了该通路(第页值0.04），以及在绿色阴影框中下调的特定基因
图5
图5
α7nAchR激活诱导典型Nrf2抗氧化基因的上调。一GTS21（15和30μm）预处理1 h后，LPS处理24 h的星形胶质细胞中典型Nrf2抗氧化基因HO1、TXNRD1和GCLC显著上调。α7nAchR拮抗剂MLA（1μm）显著降低了这种效应，表明这种反应的特异性*第页与LPS相比<0.05，60 ng/ml治疗，# 第页与GTS21 30μm+LPS 60 ng/ml相比，<0.05（均使用单向方差分析，并使用Tukey检验调整多重比较）。误差条代表SD(n个 = 4).b条使用western blot在LPS处理24 h的星形胶质细胞中观察到GTS21（30μm）处理后HO1、NQO1和TXNRD1的蛋白水平显著增加，而1μmα7nAchR拮抗剂MLA阻止了这一作用*第页与LPS 60 ng/ml治疗相比<0.05，# 第页与GTS21 30μm+LPS 60 ng/ml治疗组相比，<0.05（均使用单向方差分析，并使用Tukey检验调整多重比较）。误差条代表SD(n个 = 3)
图6
图6
α7nAchR激活的抗氧化和抗炎反应依赖于Nrf2。一GTS21（15和30μm）预处理导致经LPS（60 ng/ml）处理24 h的野生型星形胶质细胞培养物中典型的Nrf2抗氧化基因HO1、TXNRD1、GCLC和OSGIN1显著上调，但在Nrf2基因敲除小鼠的星形胶质细胞中没有上调*第页与LPS（60 ng/ml）治疗组相比<0.05（单因素方差分析，使用Dunnett检验对多重比较进行调整）。误差条表示SD(n个 = 4).b条用GTS21（15和30μm）对Nrf2基因敲除小鼠分离的星形胶质细胞进行1小时的预处理，用LPS（60 ng/ml）处理24小时，可显著减少促炎细胞因子TNF-α分泌的阻断(~ 22%）与野生型小鼠培养的星形胶质细胞相比(~ 63%). *第页与LPS（60 ng/ml）治疗相比<0.05（使用Dunnett检验对多重比较进行调整的单因素方差分析）。误差条代表SD(n个 = 4)
图7
图7
α7 nAchR激活可减少炎症性星形胶质细胞介导的神经元凋亡。一在LPS（60 ng/ml）存在下，用星形胶质细胞条件培养基处理神经元24小时，加或不加1小时GTS21预处理（30μm），caspase激活的代表性图像。b条GTS21（30μm）在LPS（60 ng/ml）激活的星形胶质细胞条件培养基中预处理1 h后，caspase激活的定量显示，神经元培养物中caspase 3/7的水平显著降低，而添加1μm MLA后，这种作用被显著阻断*第页与对照星形胶质细胞条件培养基相比，<0.05*第页与对照组相比<0.05（单向方差分析，使用Dunnett检验对多重比较进行调整）。误差条代表SD(n个=5口井，每口井15个油田）
图8
图8
α7nAchR激活降低了NF-κB荧光素酶信号，并下调了脑内NF-κ）B信号通路下游的促炎基因。一大脑半球NF-κB依赖性发光的代表性图像(n个=每组5只小鼠），使用Perkin Elmer专有软件Living Image（v4.3.1）在IVIS Spectrum仪器（马萨诸塞州霍普金顿Perkin埃尔默）上采集。在对动物实施安乐死并采集大脑后，以150 mg/kg的剂量腹腔内注射荧光素进行体外脑成像。b条通过成像测量NF-κB荧光素酶报告小鼠大脑中NF-κ的B依赖性发光。LPS（1.7 mg/kg）治疗组NF-κB荧光素酶信号显著增加，而GTS21（25 mg/kg）处理组则降低*第页与LPS治疗组相比<0.05（单因素方差分析，使用Dunnett检验对多重比较进行调整）。误差条代表的SDn个=来自两个独立实验的10只小鼠/组。c（c）NF-κB荧光素酶报告小鼠经LPS治疗后另一大脑半球的RNA分析显示，5 mg/kg和25 mg/kg GTS21治疗后，炎症细胞因子、TNF-α和IL-6的基因表达显著降低，25 mg/kg GTS21治疗可显著降低IL-1β的基因表达*第页与LPS治疗相比<0.05（单因素方差分析，使用Dunnett检验对多重比较进行调整）。误差条代表的SDn个=5只小鼠/组。d日作为Nrf2通路下游抗氧化基因的OSGIN1和HO1的表达在GTS21处理下显著增加*第页与PBS治疗相比<0.05（单因素方差分析，使用Dunnett检验对多重比较进行调整）。误差条代表的SDn个=5只小鼠/组
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