Oncolytic Reovirus Infection Is Facilitated by the Autophagic Machinery

doi:10.3390/v9100266

.2017年9月21日；9(10):266.

doi:10.3390/v9100266。

自噬机制促进溶瘤性呼肠孤病毒感染

维拉·坎普¹, Iris J C Dautzenberg公司², 罗纳德·W·林彭斯^三, 戴安娜·范登·沃伦伯格⁴, 罗布·C·霍本⁵

附属公司

¹莱顿大学医学中心分子细胞生物学系，荷兰莱顿RC 2300，邮政信箱9600。v.kemp@lumc.nl。
²莱顿大学医学中心分子细胞生物学系，荷兰莱顿RC 2300，邮政信箱9600。i.j.c.dautzenberg@lumc.nl。
^三莱顿大学医学中心分子细胞生物学系，荷兰莱顿RC 2300，邮政信箱9600。r.w.a.limpens@lumc.nl。
⁴莱顿大学医学中心分子细胞生物学系，荷兰莱顿RC 2300，邮政信箱9600。d.j.m.van_den_wollenberg@lumc.nl。
⁵莱顿大学医学中心分子细胞生物学系，荷兰莱顿RC 2300，邮政信箱9600。r.c.hoeben@lumc.nl。

PMID： 28934149
预防性维修识别码： PMC5691618型
内政部： 10.3390/v9100266

自噬机制促进溶瘤性呼肠孤病毒感染

维拉·坎普等。病毒. 2017.

.2017年9月21日；9(10):266.

doi:10.3390/v9100266。

作者

维拉·坎普¹, Iris J C Dautzenberg公司², 罗纳德·W·林彭斯^三, 戴安娜·范登·沃伦伯格⁴, 罗布·C·霍本⁵

附属公司

¹莱顿大学医学中心分子细胞生物学系，荷兰莱顿RC 2300，邮政信箱9600。v.kemp@lumc.nl。
²莱顿大学医学中心分子细胞生物学系，邮政信箱9600，2300 RC Leiden，荷兰。i.j.c.dautzenberg@lumc.nl。
^三莱顿大学医学中心分子细胞生物学系，荷兰莱顿RC 2300，邮政信箱9600。r.w.a.limpens@lumc.nl。
⁴莱顿大学医学中心分子细胞生物学系，荷兰莱顿RC 2300，邮政信箱9600。d.j.m.van_den_wollenberg@lumc.nl。
⁵莱顿大学医学中心分子细胞生物学系，荷兰莱顿RC 2300，邮政信箱9600。r.c.hoeben@lumc.nl。

PMID： 28934149
预防性维修识别码： PMC5691618型
内政部： 10.3390/v9100266

摘要

哺乳动物呼肠孤病毒是一种双链RNA病毒，可选择性感染和溶解转化的细胞，使其成为一种有吸引力的溶瘤剂。尽管有临床证据表明其具有抗肿瘤活性，但其作为独立治疗的疗效仍有待提高。对呼肠孤病毒复制和溶瘤至关重要的细胞途径的识别和调控，将极大地影响未来试验的成功。在这里，我们证明呼肠孤病毒在几个细胞系中诱导自噬，从Atg5-Atg12复合物的形成、微管相关蛋白1轻链3（LC3）脂质化、p62降解、酸性泡状细胞器的出现和LC3点状物的形成可以证明这一点。此外，在呼肠孤病毒感染细胞的电子显微镜图像中，观察到自噬体与病毒工厂没有明显关联。利用紫外线激活的呼肠孤病毒，我们证明生产性呼肠孤毒感染有助于诱导自噬。重要的是，特定自噬相关基因的敲除细胞系显示，Atg3和Atg5的表达，而不是Atg13的表达促进了呼肠孤病毒的复制。这些发现突出了自噬机制在促进呼肠孤病毒感染中的中心和Atg13独立作用，并有助于更好地理解呼肠孤毒-宿主相互作用。

关键词：自噬机制；淘汰赛；哺乳动物正呼肠孤病毒；溶瘤；复制。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
呼肠孤病毒感染在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中触发微管相关蛋白1轻链3（LC3）点。MEF被R124或jin-3感染，感染倍数（MOI）为10。或者，用1µM雷帕霉素（Rapa）处理细胞，32小时后，向经Rapa处理的细胞补充50 nM BafA1。处理48小时后固定细胞，并将呼肠孤病毒µ1C蛋白染色为红色。细胞核为蓝色（DAPI），GFP-LC3为绿色。

图2
呼肠孤病毒感染可诱导MEF中Atg5-Atg12结合、LC3-I转化为LC3-II以及p62降解。MEF感染R124或jin-3，MOI为0.1或10。在感染后48小时（hpi）在佐丹奴裂解缓冲液中制备蛋白裂解物，并通过western分析分析σ3、Atg5、LC3、p62和肌动蛋白的数量。

图3
Atg3的表达促进了呼肠孤病毒在MEFs中的复制。Atg3wt、Atg3−/−和Atg3+/+MEF感染R124或jin-3，MOI为0.1或10。48小时后，在佐丹奴裂解缓冲液中制备蛋白裂解物，并分析σ3、Atg3和肌动蛋白的表达。同时，在上清液中收集细胞，通过三个冻融循环进行溶解，并通过斑块分析测定24孔板孔中感染性病毒颗粒的总量。

图4
呼肠孤病毒的复制是由Atg5的表达促进的。Atg5wt、Atg5−/−和Atg5+/+MEF感染R124或jin-3，MOI为1。72小时后，在佐丹奴裂解缓冲液中制备蛋白裂解物，并分析σ3、Atg5和肌动蛋白的表达。或者，在上清液中收集细胞，通过三个冻融循环进行溶解，并通过斑块分析测定24孔板孔中感染性病毒颗粒的总量。

图5
呼肠孤病毒复制不受Atg13表达的影响。Atg13wt、Atg13−/−和Atg13+/+MEF感染R124或jin-3，MOI为0.1或10。48小时后，在佐丹奴裂解缓冲液中制备蛋白裂解物，并分析σ3、Atg13和肌动蛋白的表达。同时，在上清液中收集细胞，通过三个冻融循环进行溶解，并通过斑块分析测定24孔板孔中感染性病毒颗粒的总量。

图6
呼肠孤病毒感染在U87-MG和U251-MG胶质母细胞瘤细胞中诱导Atg5-Atg12结合、LC3-I到LC3-II转化以及酸性囊泡细胞器。用R124或jin-1感染U87-MG和U251-MG胶质母细胞瘤细胞，MOI为10，或用400 nM Rapa治疗。48小时（U87-MG）或54小时（U251-MG）后，在RIPA裂解缓冲液中制备蛋白质裂解物，并分析Atg5、LC3和肌动蛋白的表达。或者，在48小时（U87-MG）或120小时（U251-MG）后用吖啶橙培养细胞，并拍摄荧光显微镜照片。

图7
在R124感染的U87-MG细胞中可以观察到自噬体。U87-MG胶质母细胞瘤细胞未经治疗（Mock）或接受400 nM Rapa治疗，或感染MOI为10的R124。48小时后，将细胞固定、脱水、包埋，并用电子显微镜分析超薄细胞切片。比例尺表示4.6µm（左侧面板）或920 nm（右侧面板，左侧面板单元的5倍缩放）。AV，自噬液泡；VP，病毒颗粒。

图8
在U87-MG细胞中，需要大量紫外线活化的呼肠孤病毒颗粒来诱导Atg5-Atg12结合、LC3-I到LC3-II的转化以及酸性囊泡细胞器。U87-MG细胞在MOI为10时感染R124，或在MOI*为10、200或1000时感染UV-inactivated R124颗粒。48h后，在RIPA裂解缓冲液中制备蛋白裂解物，并分析Atg5、σ3、p62、LC3和肌动蛋白的表达。或者，将细胞与吖啶橙一起孵育，并拍摄荧光显微镜图像。

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1. Strong J.E.、Coffey M.C.、Tang D.、Sabinin P.、Lee P.W.病毒溶瘤的分子基础：呼肠孤病毒对Ras信号通路的阻断。EMBO J.1998；17:3351–3362. doi:10.1093/emboj/17.12.3351。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Lennemann N.J.，Coyne C.B.如果可以的话，抓住我：自噬与病毒之间的联系。《公共科学图书馆·病理学》。2015;11:e1004685。doi:10.1371/journal.ppat.1004685。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Daussy C.F.、Beaumelle B.、Espert L.自噬限制HIV-1感染。Oncotarget公司。2015;6:20752–20753.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Campbell G.R.，Spector S.A.通过自噬抑制人类免疫缺陷病毒1型。货币。操作。微生物。2013;16:349–354. doi:10.1016/j.mib.2013.05.006。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[1] Zhao X.，Chester C.，Rajasekaran N.，He Z.，Kohrt H.E.战略组合：呼肠孤病毒溶瘤病毒治疗的未来。摩尔癌症治疗。2016;15:767–773. doi:10.1158/1535-7163.MCT-15-0695。-内政部-公共医学

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[7] Daussy C.F.、Beaumelle B.、Espert L.自噬限制HIV-1感染。Oncotarget公司。2015;6:20752–20753.-项目管理咨询公司-公共医学

[8] Daussy C.F.、Beaumelle B.、Espert L.自噬限制HIV-1感染。Oncotarget公司。2015;6:20752–20753.-项目管理咨询公司-公共医学

[9] Campbell G.R.，Spector S.A.通过自噬抑制人类免疫缺陷病毒1型。货币。操作。微生物。2013;16:349–354. doi:10.1016/j.mib.2013.05.006。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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