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.2017年10月25日；37(43):10498-10515.
doi:10.1523/JNEUROSCI.1139-17.2017。 Epub 2017年9月18日。

新型Toll样受体4调节因子MicroRNA-1906改善小鼠实验性脑卒中后的缺血损伤

徐晓萌 1, 卓宇文 1, 赵楠（Nan Zhao） 1, 徐晓慧 1, 王芳（Fang Wang） 1, 杰高 1, 姜永军 2, 刘新峰 三
附属机构

新型Toll样受体4调节因子MicroRNA-1906改善小鼠实验性脑卒中后的缺血损伤

徐晓萌等。 神经科学. .

摘要

Toll样受体4（TLR4）是脑卒中后炎症的一种促炎级联引发剂。在本研究中，通过生物信息学在雄性成年小鼠中进行分析和microRNA谱分析，然后在缺血半球定量其表达。我们发现miR-1906在缺血半球显著富集，而在近梗死区更为显著富集。此外，在体外实验表明，在氧-葡萄糖剥夺过程中，神经胶质细胞中miR-1906的表达增加，而神经元中的表达减少。令人惊讶的是，尽管细胞内丰度增加，但星形胶质细胞培养上清液中细胞外小泡中miR-1906的表达减少，这表明从胶质细胞到神经元的miR-1906来源减少。当给予外源性miR-1906时，TLR4蛋白表达降低在体外和体内使用Cy3标记，直接观察星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元对外源性miR-1906的摄取体内在接受miR-1906治疗的大脑中动脉闭塞小鼠中观察到梗死体积减少和功能结果改善。然而，随着TLR4基因敲除，miR-1906的保护作用消失，表明TLR4是miR-1905的主要靶点，microRNA通过其发挥治疗作用。重要性声明目前的研究确定miR-1906是Toll样受体4（TLR4）的一种新的特异性调节因子，并描述了其在缺血性发作期间不同脑区和细胞类型的不同表达模式。因此，治疗性补充miR-1906有助于调节中风后炎症。使用Cy3标记，可以观察到外源性miR-1906的表达，并显示其成功进入星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元体内在小鼠模型大脑中动脉闭塞后，补充治疗miR-1906导致TLR4表达降低，结果改善，但其神经保护功能依赖于TLR4，表明TLR4是miR-1905的主要靶点。

关键词：Toll样受体4；脑血管病；炎症；微RNA；(打、击等的)一下。

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数字

图1。
图1。
TLR4 KO降低MCAO后梗死体积和神经功能缺损。A类，WB证实成功消融TLR4蛋白表达(n个= 3).B类,C类，TLR4 KO导致MCAO后神经功能改善。在改良的神经系统严重程度评分系统的子项目中，TLR4 KO主要有助于改善平衡木测试的表现(第页= 0.0012). KO小鼠的总分也较低(第页= 0.0175).D类、TTC染色的WT和KO组假小鼠和MCAO小鼠冠状脑切片的代表性图像。E类，第一、第二和第三节检测到梗死面积显著减少(第页分别为0.0228、0.0146和0.0352）。F类，KO组总脑梗塞体积也减少(第页= 0.0188). *第页<0.05学生t吨测试，n个= 4–8.
图2。
图2。
TLR4靶向微小RNA的系统筛选和验证。A类系统筛选流程图。B类，组合生物信息学随后的实验中包括了微阵列分析。从TargetScan和miRanda数据库中，分别检索到144和226个microRNA作为小鼠TLR4的预测调节因子。显著改变（倍数变化>2，第页MCAO后，通过微阵列分析，在114个microRNAs中发现表达<0.01）。这个生物信息学微阵列分析包括12个microRNA。C类，其中12例MCAO后增加6例，减少6例(n个= 3).D类，PCR测定的12个microRNA的表达水平(n个= 6). 四种microRNAs（miR-1906、miR-337-3p、miR-148b-3p和miR-380-3p）的表达显著增加，尽管后三种microRNA（miR-337-2p、miR-148b-3p和miR-38-3p）被排除在外，因为它们的PCR结果与微阵列结果相冲突。因此，只有miR-1906(第页=0.0156）纳入后续研究。E类在双核糖核酸酶报告基因分析中，经TLR4 WT 3′-UTR mRNA序列转染的细胞中，抑制的荧光素酶活性与miR-1906 agomir相关，而与错配agomir无关。携带突变TLR4 3′-UTR mRNA序列的质粒转染的细胞无差异(n个=4，化验一式三份）。F类，miR-1906种子序列和TLR4的3′-UTR中相应的结合靶点*第页<0.05（学生）t吨测试，n个= 4–8.
图3。
图3。
TLR4和miR-1906在主要器官和大脑中的表达。A类,B类PCR和WB证实，主要器官中TLR4 mRNA和蛋白水平与大脑中的TLR4相对应。心脏TLR4 mRNA水平较高(第页=0.0003），脾脏(第页<0.0001）和肺(第页<0.0001）组织。脾脏TLR4蛋白水平(第页=0.0280）和肺(第页=0.0291）组织高于大脑中的组织（Student’st吨测试，n个=PCR为6，n个=WB为4）。C类，miR-1906在主要器官中的水平相对于在大脑中的水平。与心脏相比(第页=0.0024），肝脏(第页=0.0067），脾脏(第页=0.0039），肺(第页=0.0024），肾脏(第页=0.0169）和肌肉(第页=0.0072）组织，大脑表现出显著的miR-1906富集（Student’st吨测试，n个= 6).D类,E类TLR4 mRNA和蛋白质在大脑不同区域相对于皮层的水平。F类大脑不同区域的miR-1906水平。嗅球中TLR4 mRNA水平明显高于皮层(第页<0.0001）。在皮层和其他大脑区域之间未检测到显著差异（Student’st吨测试，n个= 6). TLR4蛋白的表达（学生t吨测试，n个=4）和miR-1906（学生t吨测试，n个=6）与大脑皮层相比，每个大脑区域在统计学上是等效的*第页<0.05（学生）t吨测试，n个如图所示。
图4。
图4。
MCAO后miR-1906和TLR4的时空表达谱。A类近梗死区miR-1906水平显著升高（3.34倍，第页=0.0246），早在再灌注后2 h，在第4 h达到峰值（10.54倍，第页<0.0001），并在再灌注24小时内保持较高水平。B类在缺血核心区，miR-1906的表达在再灌注后4小时开始增加（5.87倍，第页=0.0032），并且在再灌注12小时内，升高仍然显著。C类TLR4的mRNA水平在近梗死区没有表现出统计学意义上的显著增加。D类在缺血核心区，TLR4 mRNA丰度在再灌注6 h时显著增加（5.457倍，第页=0.0257），并保持升高长达24小时（10.52倍，第页= 0.0456).E类,G公司，TLR4蛋白水平在再灌注第二小时在两个近梗死区均升高（1.61倍，第页=0.0279）和F类,H（H）缺血核心（1.47倍，第页=0.0331），但在再灌注后4–24小时恢复到正常水平*第页<0.05（学生）t吨试验中，每个样本与假手术组进行比较，n个=6。
图5。
图5。
现场杂交显示缺血边界周围的miR-1906+细胞（箭头）。星号表示右侧的放大区域。A类–C类，假手术组相应的大脑皮层。D类–F类，缺血皮质梗死周围区域。缺血边界用红色虚线表示。在缺血边界周围观察到miR-1906+细胞的聚集。G公司–我，缺血皮质的缺血核心。观察到细胞和细胞核收缩是细胞死亡的标志。尽管检测到了miR-1906，但与梗死周围区域观察到的miR-1906+细胞相比，其密度较低。比例尺：A类,D类,G公司500微米；B类,E类,H（H），100微米；C类,F类,我，50微米。n个= 3.
图6。
图6。
OGD后星形胶质细胞、小胶质细胞、神经元和EV中miR-1906表达差异在体外.A类在星形胶质细胞中，miR-1906的表达随着OGD持续时间的延长而增加，并且在6小时后增加具有统计学意义（1.78倍，第页=0.0395），8小时（2.10倍，第页=0.0045）和10小时（4.29倍，第页=0.0116）OGD(n个= 6).B类、碘化丙啶-星形胶质细胞在OGD不同时间点的Hochest染色。因为10小时的OGD会导致细胞过度死亡，所以后续实验使用8小时OGD。C类在小胶质细胞中，miR-1906的表达在8小时后显著增加（3.49倍，第页=0.0129）和10小时（3.11倍，第页=0.0001）OGD(n个= 6).D类OGD 10 h后，大多数小胶质细胞死亡且无黏附，因此不适合随后的表达。因此，还选择了8小时OGD用于随后的小胶质细胞实验。E类在神经元中，miR-1906的表达在0.5小时后显著降低（0.66倍，第页=0.0058），2小时（0.39倍，第页=0.0016）和2.5小时（0.31倍，第页OGD的<0.0001）(n个= 3).F类对于神经元，选择2小时OGD，因为2.5小时OGD会导致细胞数量显著减少。G公司，OGD 8h后，星形胶质细胞培养上清液中EVs中miR-1906的丰度降低（0.01倍，第页= 0.0471,n个= 5). *第页<0.05（学生）t吨试验中，每个样本与假手术组进行比较，n个如图所示。比例尺，50μm。
图7。
图7。
miR-1906阿基米尔在蛋白水平上抑制星形胶质细胞TLR4的表达，但在mRNA水平上不抑制在体外.A类miR-1906的细胞内丰度随着miR-1906agomir剂量增加到最终浓度50、100和200 n而急剧增加米，分别（与对照组相比，学生的t吨测试，n个= 3).B类，在任何测试浓度下均未观察到TLR4 mRNA表达降低（与对照组相比，Student’st吨测试，n个= 4).C类,D类，在接受终浓度为50、100和200μm的miR-1906 agomir的星形胶质细胞培养物中，TLR4蛋白表达降低米（0.56倍，第页= 0.0299; 0.39倍，第页= 0.0445; 和0.34倍，第页分别=0.0160；与相同剂量的失配控制相比，学生的t吨测试，n个= 4).E类用共焦激光扫描显微镜通过免疫荧光观察TLR4蛋白和给药阿吉米的结肠化。放大的视图用虚线框标记。在正常条件下和OGD 8小时后，miR-1906和失配激动剂均能穿透培养的星形胶质细胞。在正常情况下，与那些接受错配agomir的星形胶质细胞相比，接受miR-1906 agomir星形胶质细胞检测到TLR4信号减弱。此外，miR-1906 agomir信号较强的细胞显示TLR4信号低于miR-1906agomir积累较少的细胞（箭头）。OGD 8h后，细胞出现损伤和损伤，表现为萎缩和折叠形态。与正常情况下的情况一致，尽管OGD和miR-1906 agomir与TLR4信号降低相关，但星形胶质细胞中仍累积有miR-1905和错配agomir*第页< 0.05,n个如图所示。
图8。
图8。
miR-1906阿基米尔抑制小胶质细胞TLR4的表达在体外.A类在最终浓度为50、100和200 n时，miR-1906的细胞内积累随着miR-1906agomir给药的增加而急剧增加米（与对照组相比，学生t吨测试，n个= 3).B类只有当miR-1906阿基米尔浓度达到200 n时，TLR4 mRNA表达才显著降低米（0.72倍，第页=0.0395，与对照组Student’st吨测试，n个= 4).C类,D类，TLR4蛋白表达在100和200 n浓度下下降米（0.43倍，第页=0.0242和0.50倍，第页分别=0.0375；与相同剂量的失配控制相比，学生的t吨测试，n个= 4).E类，共聚焦激光扫描显微镜证实外源性阿基米尔在正常条件下和OGD 8小时后进入小胶质细胞在体外OGD后整体TLR4信号增强，miR-1906 agomir与伴有或不伴有OGD的TLR4表达减少相关*第页< 0.05,n个如图所示。
图9。
图9。
miR-1906阿基米尔抑制神经元TLR4的表达在体外.A类细胞内miR-1906表达随着miR-1906agomir剂量的增加而增加（与对照组相比，Student’st吨测试，n个= 3).B类，在测试剂量之间没有观察到TLR4 mRNA表达的显著差异（与对照组相比，Student’st吨测试，n个= 4).C类,D类最终浓度为50、100和200 n时，接受miR-1906阿基米尔的神经元TLR4蛋白表达降低米（0.50倍，第页= 0.0349; 0.44倍，第页=0.0440；和0.32倍，第页分别=0.0058；与相同剂量的失配控制相比，学生的t吨测试，n个= 4).E类，miR-1906和失配激动剂都能穿透培养的神经元在体外在正常条件下和OGD之后。在接受miR-1906试剂的细胞培养物中观察到TLR4信号减弱。接受错配agomir的神经元在OGD后表现出比接受miR-1906 agomir神经元更严重的整体损伤，主要基于轴突和树突的完整性。标尺，50μm（上标尺），10μm（下标尺）*第页< 0.05,n个如图所示。
图10。
图10。
外源性miR-1906抗体的生物学功能在体外.A类–C类，外源性miR-1906阿基米尔的给药导致细胞内miR-1905水平增加，这在星形胶质细胞OGD后持续存在(第页=0.0418和第页=0.0266），小胶质细胞(第页=0.0260和第页=0.0059）和神经元(第页=0.0326和第页=0.0273），分别通过比较正常和OGD条件下的agomir和失配控制组确定。学生的t吨测试，n个= 3.D类OGD导致星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元TLR4蛋白表达增加。在星形胶质细胞、小胶质细胞和接受miR-1906抗体的神经元中观察到蛋白质水平降低体内. *第页< 0.05,n个如图所示。
图11。
图11。
如GFAP和Cy3荧光的共定位所示，MCAO后外源性miR-1906和错配阿基米尔均穿透WT和KO小鼠的星形胶质细胞。在接受miR-1906阿基米尔的WT小鼠中TLR4信号减弱，在KO小鼠的脑切片中几乎检测不到TLR4。放大的视图用虚线框标记。
图12。
图12。
Iba-1和Cy3荧光的定殖表明，miR-1906和错配阿基米尔在MCAO后均能进入WT和KO小鼠的小胶质细胞。在接受miR-1906阿吉米的WT小鼠中TLR4信号的总强度降低，在KO小鼠中几乎检测不到。放大的视图用虚线框标记。
图13。
图13。
Cy3和βIII-管蛋白荧光在WT和KO脑切片中共定位，表明miR-1906和错配的阿基米尔均被神经元摄取体内接受miR-1906 agomir的WT小鼠表现出较少的TLR4信号荧光，在KO小鼠中几乎检测不到荧光。放大的视图用虚线框标记。比例尺：50μm（比例尺上限），10μm（比例尺下限）。
图14。
图14。
miR-1906 agomir的生物学功能体内动物的大脑被分为近区(A类,C类)和缺血核心(B类,D类)MCAO后24小时。在准发区(A类)，miR-1906在WT中的表达显著增加(第页=0.0209）和KO小鼠(第页=0.0334），而miR-1906的增加在缺血核心区达到边际显著性（WT:第页=0.0561，KO：第页=0.0599），这可能是由于严重的细胞死亡。相应地，在近梗死区检测到TLR4蛋白表达受到抑制(C类)和缺血核心(D类)注射miR-1906的WT动物。MRI扫描采用两种MR序列：T2和DWI。如示意图所示，从每组的一只动物身上采集了不同冠状动脉切片的两个代表性图像(E类,F类). 与那些接受错配阿基米尔的小鼠相比，接受miR-1906阿基米尔治疗的WT小鼠的梗死体积显著减少，如T2所示(E类,G公司,第页=0.0043）和DWI(F类,H（H）,第页=0.0260），而在KO动物中没有观察到显著差异（T2：第页=0.3049，DWI：第页= 0.1630). *第页单因素方差分析和Fisher最小显著性差异<0.05事后（post-hoc）测试，n个= 4.
图15。
图15。
组织损伤和神经功能评估。H&E染色显示大脑组织损伤减轻，皮层内的空泡减少(A类). 根据缺血核心内细胞核的收缩形态，用虚线手动标记缺血边界线。FJC染色(B类)和TUNEL分析(C类)结果表明，与接受错配阿基米尔的WT动物相比，接受miR-1906阿基米耳的WT小鼠的神经元变性和凋亡减轻，而TLR4 KO组的整体神经元变性和细胞凋亡不太严重，无论接受哪种阿基米尔都是如此。(D类)，使用mNSS进行的神经功能缺损评估表明，miR-1906 agomir与WT动物的功能结果改善相关(第页=0.0390），但不包括KO动物(第页=0.973）(E类). 在子项目中，平衡木测试得分存在显著差异(第页< 0.0001). *第页<0.05，单因素方差分析和Fisher最小显著性差异事后（post-hoc）测试，n个= 4.
图16。
图16。
在MCAO后，miR-1906的调节通过以时间依赖的方式靶向TLR4影响缺血后炎症。脑室内注射miR-1906阿戈米尔和安替戈米尔改变了近梗死区TLR4蛋白表达的时间进程(A类)和缺血核心(B类). 再灌注2 h后，近梗死区TLR4表达显著升高(第页=0.0011），24小时后显著下降(第页=0.0304），这在接受miR-1906阿基米尔或安替戈米尔的组中没有观察到。miR-1906 agomir在再灌注后2 h抑制TLR4的表达（与agomir的错配：第页= 0.0231; 阿戈米尔vs安塔戈莫：第页= 0.0149). 接受miR-1906 antagomir的动物在假手术组中TLR4表达增加（与antagomir:第页=0.0399，agomir vs antagomor：第页=0.0449）和再灌注24小时后与接受阿基米尔治疗的患者相比(第页= 0.0068). 在缺血核心区，接受错配控制的动物在再灌注后2 h显示TLR4表达显著增加（错配控制组，假手术组vs 2 h：第页=0.0024），24小时后下降（不匹配对照组，2小时vs 24小时：第页= 0.0005). miR-1906 agomir组观察到类似的模式（假手术组vs 2 h：第页= 0.0083; 2小时与24小时之间的边际显著性：第页=0.0056），但在miR-1906抗Gomir组中没有（假手术vs 2小时：第页= 0.0002; 假手术vs 24小时：第页= 0.0022). 相反，miR-1906 agomir组在假手术组显示TLR4表达受到抑制（错配vs agomir：第页=0.0343；阿戈米尔vs安塔戈米尔：第页=0.0310）和2 h组（失配vs agomir：第页= 0.0107; 阿戈米尔vs安塔戈米尔：第页=0.0010）。此外，在MCAO后24小时，miR-1906 antagomir组检测到TLR4水平升高（与antagomir:第页= 0.0004; 阿戈米尔vs安塔戈米尔：第页< 0.0001).C类,D类miR-1906给药后，炎症标记物在梗死周围区和缺血核心区的表达显著受到抑制。在标记物中，IL-1β(第页=0.0112），TNF-α(第页=0.0373），iNOS(第页=0.0440）和MCP-1(第页=0.0460）在近梗死区表达减少(D类)，而IL-1β表达(第页=0.0318）在缺血核心区也减少(E类). 对于A类和B类: *第页<0.05，在不同时间点接受相同治疗的组间比较（错配控制、agomir或antagomir）#第页<0.05，在同一时间点接受不同治疗组之间的比较，单因素方差分析和Fisher最小显著性差异事后（post-hoc）测试，n个= 3. 对于C类和D类: *第页<0.05，学生的t吨测试，n个= 4.
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