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.2017年10月；23(10):1176-1190.
doi:10.1038/nm.4400。 Epub 2017年9月18日。

依赖KLF4的血管周细胞可塑性介导转移前生态位的形成和转移

米拉·穆尔盖 1, 魏菊 1, 马修·伊森 1, 杰西卡·克莱恩 1, 丹尼尔·W·伯里 1, 萨宾娜·卡扎诺夫斯卡 1, Markku M Miettinen公司 2, 迈克尔·克鲁拉克 三, 海燕雷 1, 杰克·谢恩 1, 奥尔加A切雷帕诺娃 4 5, 加里·欧文斯 4, 罗珊德拉·卡普兰 1
附属公司

依赖KLF4的血管周细胞可塑性介导转移前生态位的形成和转移

米拉·穆尔盖等。 自然·医学. 2017年10月.

摘要

为了开发提高患者生存率的新疗法，需要对转移过程有更深入的了解。由造血细胞、基质细胞和细胞外基质（ECM）组成的转移前生态位的形成促进了远处器官中转移性肿瘤细胞的生长和存活。血管周细胞，包括血管平滑肌细胞（vSMCs）和周细胞，参与新血管的形成并促进干细胞的维持和增殖。鉴于血管周细胞具有良好的可塑性，我们假设血管周细胞在转移部位同样调节肿瘤细胞的命运。我们使用血管周细胞特异性和血管周细胞特异性的血统追踪模型来追踪血管周细胞在转移前和转移后微环境中的命运。我们发现血管周细胞在肿瘤分泌因子的作用下失去了传统vSMC和周细胞标记物的表达，并表现出增殖、迁移和ECM合成增加。在这些表型转换的血管周细胞中，多能性基因Klf4的增加表达促进了分化程度较低的状态，其特征是ECM的生成增强，从而建立了富含纤维连接蛋白的前介导环境。血管周细胞中Klf4基因失活可减少转移前生态位的形成和转移。我们的数据揭示了血管周围细胞在转移前生态位形成中以前未被证实的作用，并揭示了限制转移的新策略。

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数字

图1
图1。转移前肺血管周围表型转换被激活
（a-b）B16-F10黑色素瘤荷瘤Myh11谱系追踪小鼠（b）在肿瘤注射后第10天，其转移前肺部显示eYFP表达的谱系追踪血管周细胞（eYFP-橙色）的扩张，与非荷瘤小鼠（a）的肺相比，这些细胞可在整个实质中发现其中eYFP表达的谱系追踪细胞仅在血管和周围气道周围发现，并表达血管周围标记物平滑肌α-肌动蛋白（ACTA2，绿色）。DAPI核染色显示为蓝色。棒材=50µm。（c）肿瘤注射后第10天，对B16-F10荷瘤Myh11谱系追踪小鼠和同胞HBSS注射Myh11细胞系追踪小鼠肺部免疫荧光图像中DAPI+eYFP+颗粒进行计算分析，这表明与HBSS治疗小鼠相比，荷瘤小鼠每20×视野中eYFP+DAPI+颗粒的数量增加。n=8只小鼠/治疗组**P（P）<0.001，学生t吨-测试。中心线表示中值，方框边缘表示25第个和75第个百分位数和胡须延伸到最小值和最大值。（d）计算分析量化肿瘤注射后第10天B16-F10荷瘤Myh11谱系追踪小鼠肺部免疫荧光图像中DAPI+eYFP+颗粒与最近血管（BV）的接近程度，并与同胞HBSS注射对照Myh11血系追踪小鼠进行比较，这表明，与同胞注射HBSS的对照组相比，转移前肺中距离最近血管较远的DAPI+eYFP+颗粒的平均频率增加。n=8只小鼠/治疗组***P（P）<0.0001，方差分析。（e）B16-F10黑色素瘤荷瘤Myh11谱系追踪小鼠在肿瘤后第3、5和10天的转移前肺的时间进程，与非荷瘤HBSS注射对照Myh11基因系追踪小鼠进行比较。HBSS MYH11血统追踪小鼠血管周围的eYFP+（橙色）、MYH11+（洋红色）和ACTA2+（绿色）细胞。在第3天观察到在PECAM+（红色）血管（V）附近不是ACTA2+（绿色）的eYFP+（橙色）MYH11+（品红色）细胞，而远离血管（V，到第10天，eYFP+MYH11-细胞在距离血管更远的地方聚集。箭头表示表型转换的eYFP+血管周细胞。每个时间点下方都显示了插图。棒材=20µm。（f）通过共聚焦图像定量每个场同时为MYH11+和ACTA2+的谱系追踪eYFP+细胞百分比，比较MYH11谱系追踪HBSS对照小鼠（上图）和转移前B16-F10天荷瘤小鼠（下图）的肺部。每个治疗组8只小鼠的平均值；对于HBSS，SD=3.447；对于B16-F10第10天，SD=4.281。（g）流式细胞术分析B16-F10转移前肺与同胞HBSS注射对照组（第0天）的肺eYFP+细胞随时间变化的Myh11谱系追踪肺。左侧显示了第10、16和18天与第0天相比增加的eYFP+细胞总数。左中点表示eYFP+ACTA2+细胞在不同时间点减少。右中点表示eYFP+Ki67+细胞，与第0天相比，这些细胞在所有肿瘤发生时间点显著增加。右图所示为eYFP+PDGFRa+CD51+细胞，与第0天相比，在第5、10、16和18天增加。最左侧和最右侧面板的样本大小（以及p值与第0天的方差分析）如下：第0天n=4；第3天n=5；第5天n=12；第10天n=12；第16天n=4；第18天n=4。左中面板的样本大小如下：第0天n=7；第3天n=5；第5天n=9；第10天n=12；第16天n=4；第18天n=4。右中面板的样本大小如下：第0天n=7；第3天n=5；第5天n=9；第10天n=6；第16天n=4；第18天n=4*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.001, ***P（P）<0.0001，以及****P（P）<0.00001，方差分析。中心线表示中值，顶线和底线表示25第个和75第个百分位数。（h-i）在另一个转移前模型M3-9M转移性横纹肌肉瘤模型中观察到血管周围表型转换。与非肿瘤携带Myh11血统追踪小鼠（h）的肺部相比，转移前携带肿瘤的Myh11血系追踪小鼠（i）在肿瘤注射后第10天表现出eYFP表达的血统追踪细胞（橙色）数量增加，这些细胞在血管周围不再出现（V）PECAM1标记的内皮细胞（红色）和ACTA2标记的血管平滑肌细胞（绿色）等成分。棒材=20µm。（j）肿瘤注射后第10天，计算分析定量M3-9M横纹肌肉瘤荷瘤Myh11系追踪小鼠转移前肺部免疫荧光图像中DAPI+eYFP+颗粒，与HBSS处理的Myh11谱系追踪小鼠相比，每4×3平铺场中eYFP+DAPI+粒子数增加。n=7 HBSS；n=8 M3-9M***P（P）<0.0001，学生的t吨-测试。中心线表示中值，方框边缘表示25第个和75第个百分位数和胡须延伸到最小值和最大值。（k）根据共聚焦图像定量分析Myh11血统追踪HBSS对照小鼠（上图）与转移前的M3-9M横纹肌肉瘤第10天荷瘤小鼠（下图）肺部中每场ACTA2+的血统追踪eYFP+细胞百分比。每个治疗组8只小鼠的平均值；对于HBSS，SD=2.325；M3-9M第10天的SD=1.613。（l）与Myh11血统追踪小鼠的同胞HBSS注射对照组相比，肿瘤注射后第10天M3-9M荷瘤小鼠肺部免疫荧光图像中DAPI+eYFP+颗粒与最近血管（BV）的接近程度的计算分析，这表明，与同胞注射HBSS的对照组相比，转移前肺中距离最近血管较远的DAPI+eYFP+颗粒的平均频率增加。n=8只小鼠/治疗组。
图2
图2。转移前肺中表达NG2的周细胞被激活
（a）Myh11系追踪小鼠肺部的eYFP+细胞（橙色）在血管（V）周围表达周细胞标记物NG2（红色），并表达血管周标记物ACTA2（绿色）和Myh11（洋红色）。DAPI核染色显示为蓝色。20倍放大的共焦图像，右侧为单通道荧光图像。箭头表示eYFP+NG2+MYH11+ACTA2+细胞。条形=20µm（b）流式细胞术分析B16-F10转移前肺中Myh11谱系追踪肺的eYFP+NG2+细胞随时间变化的情况，并与同窝HBSS注射对照组（第0天）的肺进行比较，结果表明，随着时间的推移，Myh11基因追踪小鼠转移前肺的eYFP+NG2+细胞显著增加。n=6天0；n=6天3；n=5天5；n=5第10天**P（P）<0.001，方差分析。中心线表示中值，顶线和底线表示25第个和75第个百分位数。（c-g）B16-F10黑色素瘤荷瘤NG2谱系追踪小鼠（e）在肿瘤注射后第10天的转移前肺中，eYFP表达的谱系追踪周细胞（eYFP-橙色）扩张，这些周细胞可以在远离血管的整个实质中发现，与同窝HBSS注射对照组的肺相比（c），其中eYFP表达的谱系追踪细胞很少见，仅在PECAM染色的血管（V）周围发现（红色），并表达血管周围标志物平滑肌α-肌动蛋白（ACTA2，绿色）。注射低转移性B16-F0黑色素瘤细胞系的NG2血统追踪小鼠未表现出明显的eYFP+细胞向肺实质扩张（d）。E0771荷瘤小鼠（f）和M3-9M荷瘤鼠（g）的转移前肺表现出eYFP+细胞的扩张。DAPI核染色显示为蓝色。棒材=20µm。（h-i）共聚焦成像显示肿瘤注射后第10天（箭头）（转移前的时间点），B16-F10荷瘤NG2系追踪小鼠（j）的NG2+（红色）PDGFRb+（绿色）MYH11+（品红色）eYFP+血管周细胞（橙色）不再与肺部血管密切相关，与NG2+PDGFRb+MYH11+eYFP表达细胞相反，后者在注射HBSS的母鼠对照组的血管周围发现。DAPI核染色显示为蓝色。棒材=10µm。（j）在肿瘤后第10天注射NG2谱系追踪小鼠的三个转移前模型的肺部免疫荧光图像中，计算分析量化DAPI+eYFP+颗粒，这表明与注射HBSS的NG2谱型追踪小鼠相比，每4×3平铺图像场中eYFP+DAPI+颗粒的数量增加。左图显示了B16 F10转移性黑色素瘤荷瘤小鼠与同窝注射HBSS的对照组（每组8只小鼠）的转移前肺的分析。中间描述了E0771转移性乳腺癌荷瘤小鼠与同胞HBSS注射对照组（HBSS n=9，E0771 n=8）的转移前肺的分析。右侧描述了M3-9M转移性横纹肌肉瘤荷瘤小鼠与非荷瘤同窝HBSS注射对照组（HBSS n=6；M3-9M n=7）转移前肺的分析****P（P）<0.00001，学生t吨-测试。中心线表示中值，顶线和底线表示25第个和75第个百分位数。（k）肿瘤后第3天、第5天和第10天用转移性B16 F10细胞系注射NG2系追踪小鼠的流式细胞术分析表明，与非肿瘤对照HBSS注射小鼠相比，转移前肺部发现的eYFP+周细胞衍生细胞的总数增加。第0天n=6；第3天n=5；第5天n=5；第10天n=6***P（P）< 0.0001, ****P（P）<0.00001，方差分析。中心线表示中值，顶部和底部线表示25第个和75第个百分位数。
图3
图3。转移性肿瘤衍生因子促进KLF4依赖性血管周细胞表型转换的激活
（a）描述血管周围细胞表型转换特征的示意图。平滑肌细胞和周细胞处于收缩状态，它们在血管周围表达ACTA2和MYH11等标记基因。作为对炎症微环境提示的反应，血管周围细胞表达KLF4并进入合成状态，在那里它们下调标记基因的表达，增加增殖、迁移和ECM的生成。（b）计算分析量化Myh11谱系追踪小鼠B16 F10肿瘤注射后第10天转移前肺部免疫荧光图像中DAPI+eYFP+为KLF4+的颗粒百分比，与注射HBSS的对照Myh11血统追踪小鼠相比，eYFP+DAPI+为KLF4+的颗粒数量增加。n=8个/治疗组***P（P）<0.0001，学生t吨-测试。中心线表示中值，方框边缘表示25第个和75第个百分位数和胡须延伸到最小值和最大值。（c）在肿瘤注射后第10天，对B16 F10肿瘤注射小鼠的Myh11谱系追踪肺进行流式细胞术分析，与同窝HBSS注射Myh11细胞追踪对照小鼠的肺相比，表明转移前肺中发现的eYFP+细胞（也是KLF4+细胞）的比例显著增加。每组9只小鼠*P（P）<0.05，学生的t吨-测试。中心线表示中值，方框边缘表示25第个和75第个百分位数和胡须延伸到最小值和最大值。（d-e）与HBSS注射对照Myh11血统追踪小鼠（d）相比，在肿瘤注射后第10天，B16-F10黑色素瘤荷瘤Myh11细胞系追踪小鼠（e）的转移前肺中含有表达多潜能标记物KLF4（红色）的eYFP+血统追踪血管周细胞亚群（eYFP，橙色），不再局限于血管周围位置，并开始失去血管周围标志物ACTA2（绿色）和Myh11（品红色）的表达。右图显示转移前肺中eYFP+人群的放大插图。这些eYFP+ACTA2低的我的11低的KLF4型你好用箭头表示的血管周细胞是表型转换的标志。背景减影MFI用于指定低med-hi名称：ACTA2低<=100，100<med<1000，1000<=hi；MYH11低<=200，200<med<1000，1000<=hi；KLF4低<=250，250<中等<800，1000<=高。DAPI核染色显示为蓝色。棒材=20µm，嵌入棒材=10µm。（f-g）暴露于转移性B16-F10肿瘤条件培养基（TCM）（g）的非肿瘤荷瘤Myh11系追踪小鼠的肺表现出eYFP+系追踪血管周细胞（eYFP，橙色）的扩张，与暴露于非恶性黑素细胞TCM（f）的非瘤荷瘤小鼠的肺相类似其中，在PECAM+血管（红色）和周围气道周围发现eYFP+血统追踪细胞，并表达血管周围标记物ACTA2（绿色）和Myh11（洋红色）。DAPI核染色显示为蓝色。Myh11系追踪小鼠腹腔注射转移性B16 F10或非肿瘤黑色素瘤细胞系的中药，每天一次，连续14天6次。棒材=20µm。（h-i）暴露于转移性B16-F10肿瘤衍生外泌体的非肿瘤荷瘤Myh11系追踪小鼠的肺（i）显示出eYFP+系追踪血管周细胞（eYFP，橙色）的扩张，与暴露于非恶性黑素细胞外泌物的非肿瘤载瘤小鼠的肺相似（h）其中eYFP+血统追踪细胞仅在PECAM+血管（红色）和周围气道周围发现，并表达血管周围标记物ACTA2（绿色）和MYH11（洋红色）。DAPI核染色显示为蓝色。将从转移性B16F10和非肿瘤黑色素瘤细胞系的条件培养基中分离的外泌体腹腔注射Myh11系追踪小鼠，每天注射一次，连续14天6次。棒材=20µm。（j）对Myh11系追踪小鼠肺部免疫荧光图像中DAPI+eYFP+颗粒进行计算分析，这些小鼠腹腔注射了来自非肿瘤黑素细胞或转移性肿瘤B16 F10细胞系的TCM（左图）或外泌体（右图），与黑素细胞TCM或外体处理小鼠相比，B16 F10 TCM或外体处理小鼠每20×视野中eYFP+DAPI+颗粒的数量增加。每个测量值代表每只小鼠五个染色场。n=每个治疗组3只小鼠*P（P）< 0.05, **P（P）<0.001，学生t吨-测试。中心线表示中值，方框边缘表示25第个和75第个百分位数和胡须延伸到最小值和最大值。（k）培养的vSMC的RNA-Seq热图分析在体外显示激活标记上调的基因表达Klf4公司和Pdgfra公司血管周围标志物的下调学报2,我的11和胶转蛋白对转移性B16-F10条件培养基（F10-TCM）的反应，与无血清培养基（SFM）培养细胞相比，红色表示高表达，蓝色表示低表达。（l）灵巧路径分析从使用B16-F10中药与SFM体外培养的vSMCs中收集的基因表达数据中的高度富集路径（阳性激活分数），证明增殖和迁移路径（橙色）在72小时内激活。（米）培养vSMC在体外被转染了Klf4公司启动子报告质粒激活Klf4公司启动子报告子诱导分泌型高斯荧光素酶的表达。然后将转染的vSMC进行siRNA靶向Klf4公司-目标（siKLF4）或非目标控制序列（siNT）。转染24小时后，用含有以下重组蛋白之一的无血清培养基替换培养基：WISP1、Ang2或IL1ß。用重组蛋白治疗16小时后，定量分泌荧光素酶水平，并证明多种重组蛋白激活Klf4公司vSMCs中的启动子活性在体外. *P（P）<0.05表示siNT和siKLF4之间的比较，学生t吨-测试；†P（P）<0.05表示SFM和细胞因子治疗之间的比较，Student’st吨-测试。n=3个独立实验。中心线表示中值，方框边缘表示25第个和75第个百分位数和胡须延伸到最小值和最大值。（n）培养vSMC在体外受到siRNA靶向作用Klf4公司-目标（siKLF4）或非目标控制序列（siNT）。转染24小时后，用含有以下重组蛋白之一的无血清培养基替换培养基：WISP1、ANG2或IL1ß。用重组蛋白治疗24小时后，通过qRT-PCR分析基因表达，以证明与三种重组蛋白中的任何一种培养的vSMC都会降低血管周围标志基因的表达我的11以依赖于KLF4的方式。对于siNT或siKLF4治疗，基因表达以无血清培养基对照的倍数变化表示*P（P）<0.05表示siNT和siKLF4之间的比较，学生t吨-测试；†P（P）<0.05表示SFM和细胞因子治疗之间的比较，Student’st吨-测试。n=3个独立实验。中心线表示中值，方框边缘表示25第个和75第个百分位数和胡须延伸到最小值和最大值。（o）肿瘤细胞系来源的外泌体的Western blotting表明，在三种候选细胞因子中，仅在外泌体内检测到WISP1。值得注意的是，WISP1仅在转移性肿瘤细胞系的外泌体中发现，包括Panc02胰腺癌、B16-F10黑色素瘤、MMNG HOS骨肉瘤和HOS骨肉瘤。在非肿瘤对照黑色素瘤细胞系（Mel）和非转移性肿瘤细胞系B16-F0外泌体中均未发现WISP1。vSMC细胞裂解物（MOVAS）用作细胞因子染色的阳性对照（最右侧）。（p）ELISA检测到，转移前荷瘤小鼠血浆中WISP1水平随时间增加。样本大小如下：第0天n=5；第3天n=6；第5天n=6；第10天n=5**P（P）<0.001，方差分析。中心线表示中值，顶线和底线表示25第个和75第个百分位数。（q）转移性B16-F10外泌体或重组WISP1（rmWISP1）含有无血清培养基，在应用于vSMC之前用中和性抗ß1整合素抗体（红色）预处理在体外与用IgG控制抗体（黑色）预处理的B16-F10外泌体或rmWISP1相比，其促进vSMC增殖的能力降低。控制黑素细胞外体或非转移性B16-F0肿瘤外体不会诱导vSMC增殖，并且在整合素抑制方面没有变化。使用CellTiter Glo测量增殖。n=10个技术复制品**P（P）< 0.001, ***P（P）< 0.0001, ****P（P）<0.00001，学生t吨-测试。中心线表示中值，方框边缘表示25第个和75第个百分位数和胡须延伸到最小值和最大值。
图4
图4。活化的平滑肌细胞分泌KLF4依赖性纤维连接蛋白ECM，促进肿瘤粘附、迁移和增殖
（a-b）在Myh11血统追踪的转移前肺（b）中观察到纤维连接蛋白染色（红色）的增加，与注射HBSS的非肿瘤对照小鼠（a）相比。eYFP+细胞显示为橙色，Acta2染色显示为绿色。V表示血管。棒材=10µm。（c）由两名独立计分员测量HBSS对照组和B16-F10转移前肺部共聚焦图像中eYFP+细胞和eYFP-细胞的背景扣除平均荧光强度（MFI）。每个测量值代表每只小鼠三个染色组织切片的五个视野。n＝每个治疗组6只小鼠*P（P）< 0.05, **P（P）<0.001，学生t吨-测试。中心线表示中值，顶线和底线表示25第个和75第个百分位数。（d）eYFP+血统追踪vSMC培养体外在B16-F10肿瘤源性外泌体（F10-exo）或肿瘤条件培养基（F10-TCM）中，纤维连接蛋白染色增强（红色）。棒材=10µm。（e）与在规定无血清培养基（SFM）中培养的eYFP+细胞相比，在B16-F10肿瘤条件培养基（TCM）中体外培养72小时后，eYFP+血统追踪vSMCs的Western blotting显示纤维连接蛋白生成增加。（f）描述vSMC衍生ECM实验的示意图。培养vSMC在体外在肿瘤衍生因子（如肿瘤条件培养基或肿瘤衍生外泌体）或无血清培养基中培养72小时作为对照。然后裂解vSMC，得到包被vSMC分泌的ECM的培养皿，并用于随后的肿瘤细胞行为分析。（g）与在SFM中培养的vSMCs衍生的ECM相比，在B16 F10外泌体中培养的vSMCs的ECM（如（f）所述制备）显示出纤维结合蛋白沉积增加。棒材=10µm。（h）将B16 F10肿瘤细胞镀在按（f）所述制备的ECM涂层板上，20分钟后取出并用新鲜培养基替换。粘附在平板上的剩余肿瘤细胞通过使用Incucyte Zoom、，使用相关软件测量每个孔的汇合百分比，以证明与B16 F10 TCM或B16 F10-exosomes培养的活化vSMCs粘附在ECM上的肿瘤细胞数量比与SFM或控制黑素细胞外泌体培养的vSMCsECM粘附的肿瘤细胞数增加。展示了两个独立实验的代表性实验****P（P）<0.00001，学生t吨-测试。中心线表示中值，方框边缘表示25第个和75第个百分位数和胡须延伸到最小值和最大值。（i）将B16 F10肿瘤细胞涂布在按（f）所述制备的ECM涂层孔顶部的跨孔膜上，然后在8小时后固定并染色DAPI+细胞核。通过显微镜观察迁移至膜对面的细胞数量，并进行量化，以证明迁移至与B16 F10 TCM或B16 F10-exosomes（B16 F10-1xo）培养的激活vSMC ECM的肿瘤细胞数量增加与那些迁移到用SFM培养的vSMCs ECM或控制黑素细胞外体（Mel-exo）的细胞相比。展示了两个独立实验的代表性实验**P（P）< 0.001 ***P（P）<0.0001，学生的t吨-测试。中心线表示中值，方框边缘表示25第个和75第个百分位数和胡须延伸到最小值和最大值。（j）将B16 F10肿瘤细胞镀在按（f）所述制备的ECM涂层板上，然后在24小时后使用CellTiter Glo测量增殖。与那些被镀在SFM培养的vSMCs或对照黑素细胞外泌体（Mel-exo）的ECM上的肿瘤细胞相比，将B16-F10肿瘤细胞镀在与B16 F10 TCM或B16 F10-exo培养的激活vSMCsECM上时增殖更多。展示了两个独立实验的代表性实验****P（P）<0.00001，学生t吨-测试。中心线表示中值，方框边缘表示25第个和75第个百分位数和胡须延伸到最小值和最大值。（k）培养vSMC在体外用KLF4靶向（siKLF4）或非靶向控制序列（siNT）进行siRNA靶向。转染24小时后，用无血清培养基或B16 F10肿瘤细胞（TCM）条件培养基替换培养基。培养基处理48小时后，提取蛋白并进行western blot分析，证明肿瘤衍生因子诱导vSMCs表达纤维连接蛋白（FN1）是KLF4依赖性的。（l）描述Myh11谱系追踪KLF4敲除模型的示意图。将图1a中描述的Myh11谱系追踪模型与KLF4-flox小鼠模型杂交，这样，除了成熟vSMCs和周细胞的稳定eYFP标记外，KLF4基因的漂浮密码子的cre介导重组导致KLF4等位基因失活。三苯氧胺治疗后产生的小鼠模型被命名为KLF4Δ小鼠。（米）在注射转移性黑色素瘤B16-F10后的第10天，与荷瘤KLF4 wt/wt同胞对照组相比，KLF4Δ荷瘤小鼠转移前肺的流式细胞术分析显示，总eYFP+细胞（左侧）和eYFP+KLF4+细胞（右侧）更少。n=每组5个。不另说明。=不显著*P（P）< 0.05, **P（P）<0.001，学生t吨-测试。中心线表示中值，方框边缘表示25第个和75第个百分位数和胡须延伸到最小值和最大值。（n）在肿瘤注射后第10天，B16-F10荷瘤Myh11血统追踪KLF4Δ小鼠的转移前肺部显示，在KLF4野生型（wt/wt）转移前肺中观察到的eYFP+血统追踪血管周细胞（eYFP，橙色）的扩张在KLFΔ小鼠肺中减少，其中eYFP+谱系追踪细胞仅在血管周围和气道周围发现，并表达血管周围标志物平滑肌α-肌动蛋白（ACTA2，绿色）。DAPI核染色显示为蓝色。扩展视野平铺图像在每个相应图像中以白色矩形显示，表示如下所示的缩放区域，以证明虽然KLF4 wt/wt Myh11血统追踪小鼠展示了许多eYFP+细胞（箭头），但这些细胞不再与PECAM1标记的血管（V）相关（红色）血管平滑肌细胞（绿色）和α-平滑肌肌动蛋白（ACTA2），在B16 F10黑色素瘤注射后第10天，在KLF4Δ小鼠转移前的肺中很少发现这种eYFP+细胞。棒材=50µm，嵌入棒材=25µm。（o）与B16 F10黑色素瘤注射后第10天的荷瘤KLF4Δ小鼠的肺相比，瘤后10天荷瘤KLB4Δ鼠的转移前肺的纤维连接蛋白染色降低。棒材=10µm。（p）背景扣除KLF4野生型和KLF4Δ小鼠B16-F10转移前肺共聚焦图像中eYFP+细胞和eYFP-细胞中纤维连接蛋白染色的平均荧光强度（MFI），由两个独立记分员测量。每个测量值代表每只小鼠三个染色组织切片（共15个）的五个视野。n=每组5只小鼠*P（P）<0.05，学生的t吨-测试。中心线表示中值，顶线和底线表示25第个和75第个百分位数。
图5
图5。血管周围细胞特异性KLF4缺失减少转移
（a）将表达mCherry-luciferase的B16-F10肿瘤细胞原位注射给KLF4Δ和KLF4 wt/wt Myh11系追踪小鼠，并测量其肺部肿瘤衍生荧光素酶活性体外肿瘤后第23天注射。KLF4Δ肺组织在转移第23天的活体外肺发光与KLF4野生型室友对照组相比有所降低t吨测试每个肺的平均辐射。虚线表示用于（c）中分析的低与高发光信号的截止线。n=9 KLF4重量/重量；n=7 KLF4Δ*ˆ<0.05，学生的t吨-测试。中心线表示中值，方框边缘表示25第个和75第个百分位数和胡须延伸到不被视为离群值的最小值和最大值。（b）肿瘤注射后第23天，KLF4Δ和wt/wt Myh11谱系追踪小鼠肺部表达荧光素酶B16-F10转移性肿瘤结节的生物发光信号的代表性图像。（c）将表达mCherry-luciferase的M3-9M横纹肌肉瘤肿瘤细胞原位注射给KLF4Δ和KLF4 wt/wt Myh11系追踪小鼠，并测量其肺部肿瘤衍生荧光素酶活性体外在肿瘤注射后第26天。KLF4Δ肺组织在转移第26天进行分析，显示体外与KLF4 wt/wt同窝对照组相比，肺发光。虚线表示（f）中用于分析的无/低与高发光信号的截止线。n=9 KLF4重量/重量；n=11 KLF4Δ。中心线表示中值，方框边缘表示25第个和75第个百分位数和胡须延伸到不被视为离群值的最小值和最大值。（d）肿瘤注射后第23天，KLF4Δ和KLF4 wt/wt同窝对照小鼠肺部表达荧光素酶的M3-9M转移性肿瘤结节的生物发光信号的代表性图像。（e）在肿瘤注射后第26天，M3-9M横纹肌肉瘤荷瘤Myh11谱系追踪KLF4Δ小鼠（右）的转移肺显示，KLF4野生型（wt/wt）（左）转移肺中观察到的eYFP+谱系追踪血管周细胞（eYFP，橙色）的扩张在KLF4△小鼠的肺中减少，其中只有少数eYFP+谱系追踪细胞在远离血管和周围气道的地方被发现，并且表达血管周围标志物ACTA2（绿色）和MYH11（品红色）。DAPI核染色显示为蓝色。白色矩形包围了下面描述的区域，表明虽然在KLF4野生型小鼠的转移肺中可以发现许多eYFP+KLF4+细胞（用箭头表示），但在KLF4Δ转移肺中却找不到任何细胞，即使观察到eYFP+ACTA-MYH11-细胞。棒材=50 um。（f）计算分析量化了M3-9M注射KLF4Δ小鼠后第26天肺部免疫荧光图像中DAPI+eYFP+颗粒与最近血管（BV）的接近程度，这表明在距离KLF4△肺部最近血管较长的距离处，DAPI+e YFP+粒子的平均频率降低，与KLF4重/重同窝位M3-9M荷瘤肺的肺相比。n=9 KLF4重量/重量；n=11 KLF4Δ****P（P）<0.00001，方差分析。（g）将表达mCherry-luciferase的M3-9M横纹肌肉瘤肿瘤细胞原位注射给KLF4Δ和KLF4 wt/wt NG2系追踪小鼠，并测量其肺部肿瘤衍生荧光素酶活性体外肿瘤后第29天注射。KLF4Δ肺组织在转移第29天进行分析，显示体外与KLF4 wt/wt同窝对照组相比，肺发光。虚线表示（k）中用于分析的无/低与高发光信号的截止线。n=9 KLF4重量/重量；n=11 KLF4Δ***P（P）<0.0001，学生的t吨-测试。中心线表示中值，方框边缘表示25第个和75第个百分位数和胡须延伸到不被视为离群值的最小值和最大值。（h）肿瘤注射后第29天，KLF4Δ和KLF4 wt/wt NG2血统追踪同窝对照小鼠肺部荧光素酶表达M3-9M转移性肿瘤结节的生物发光信号的代表性图像。（i）将表达mCherry-luciferase的E0771乳腺癌肿瘤细胞原位注射给KLF4Δ和KLF4 wt/wt NG2系追踪小鼠，并测量其肺部肿瘤衍生荧光素酶活性体外肿瘤后第25天注射。KLF4Δ肺组织在转移第25天进行分析，显示体外与KLF4 wt/wt同胎NG2血统追踪对照组相比，肺发光。虚线表示（N）中用于分析的无/低与高发光信号的截止线。N=每组5只小鼠**P（P）<0.001，学生t吨-测试。中心线表示中值，方框边缘表示25第个和75第个百分位数和胡须延伸到不被视为异常值的最小值和最大值。（j）肿瘤注射后第25天，KLF4Δ和KLF4 wt/wt同胞NG2谱系追踪对照小鼠肺部荧光素酶表达E0771转移性肿瘤结节的生物发光信号的代表性图像。
图6
图6。肿瘤细胞与纤连蛋白结合的抑制作用再现血管周围KLF4依赖性转移
（a）灵巧路径分析从体外培养的B16-F10肿瘤细胞中收集的基因表达数据中的高度富集路径（阳性激活分数），这些肿瘤细胞在vSMCs的ECM上首先受到siRNA介导的敲除Klf4公司,Fn1型或两者兼而有之Klf4公司和Fn1型随后在B16-F10条件培养基（TCM）或SFM中激活。B16-F10肿瘤细胞在经非靶向siRNA（siNT）处理的vSMCs的ECM上培养时的通路分析，将B16-F10TCM与SFM进行比较，表明细胞生存、活力和增殖通路激活（橙色）。在siKlf4或siFn1处理的vSMCs（蓝色）的ECM上培养的B16-F10细胞中，这些通路未被激活。（b）如（a）所述，从培养在vSMCs ECM上的B16-F10肿瘤细胞收集的基因表达数据的层次聚类表明，siFn-TCM、siKlf4-TCM和siFn-siKlf4-TCM条件聚集在一起，并与siNT-SFM条件聚集，表明两种条件的敲除Klf4公司或Fn公司在vSMCs中，与两个基因均未被敲除时相比，与在SFM中培养的vSMCs.产生的ECM更为相似。（c）维恩图描绘了与siNT-TCM相比，每个敲除条件下的基因要么高2倍（顶部），要么低2倍（底部），表明大多数基因在siKlf4、siFn和siKlf4-siFn条件下通常受到差异调控。（d）与无血清培养基（SFM）、黑素细胞外体（Mel-exo）或B16-F0外体（B16-F0-exo）条件相比，首次在TCM、重组WISP1或B16-F10外体中培养的vSMCs ECM上培养的B16-F10-细胞增殖增加。用中和的整合素1抗体来破坏肿瘤细胞与纤维连接蛋白的结合，从而治疗B16-F10肿瘤细胞，可以减少这种增殖。展示了两个独立实验的代表性实验*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.001, ***P（P）< 0.0001, ****P（P）<0.00001，学生t吨-测试。中心线表示中值，方框边缘表示25第个和75第个百分位数和胡须延伸到最小值和最大值。（e）更新的示意图总结在体外研究发现，肿瘤分泌因子，包括含有WISP-1的外泌体，导致KLF4依赖性ECM，其中含有增加的纤维连接蛋白，进而促进依赖于整合素1的肿瘤细胞增殖。（f）总结实验设计的示意图体内实验如（G-J）所示。对KLF4野生型和KLF4Δ小鼠进行原位肿瘤注射，并允许在肿瘤注射后7天内建立转移前的生态位变化。在转移前生态位形成后的16天内，使用中和的ß1整合素抗体或RGDS肽药物或相应的对照药物破坏纤维连接蛋白结合。在药物治疗期结束时评估每只小鼠的转移情况。（g）使用中和化整合素1抗体治疗的KLF4Δ和KLF4 wt/wt NG2系追踪同窝对照小鼠的肺部中表达荧光素酶的M3-9M转移性肿瘤结节发出的生物发光信号（如（f）（右）所述），与使用IgG对照抗体治疗的小鼠进行比较（左）。中心线表示中值，顶线和底线表示25第个和75第个百分位数。（h）检测到发光信号体外如（g）所述，KLF4Δ和KLF4 wt/wt小鼠的肺部中体外与IgG对照治疗相比，抗ß1整合素治疗的KLF4 wt/wt小鼠的肺发光水平与KLF4Δ小鼠相似。n=7 KLF4 wt/wt IgG；n=8 KLF4 wt/wt抗ß1整合素；n=6 KLF4ΔIgG；n=10 KLF4Δ抗-ß1整合素。不另说明。=不显著**P（P）<0.001，学生t吨-测试。中心线表示中值，顶线和底线表示25第个和75第个百分位数。（i）使用RGDS肽治疗的KLF4Δ和KLF4 wt/wt NG2谱系追踪同窝对照小鼠肺中表达荧光素酶的M3-9M转移性肿瘤结节发出的生物发光信号的代表性图像，如（f）（右）所述，与使用对照肽治疗的小鼠进行比较（左）。（j）检测到发光信号体外如（g）所述，KLF4Δ和KLF4 wt/wt小鼠的肺部中体外与对照肽治疗相比，RGDS肽对KLF4 wt/wt小鼠的肺发光水平与KLF4Δ小鼠相似。n=9 KLF4 wt/wt肽对照；n=8 KLF4重量/重量RGDS；n=7 KLF4Δ肽对照；n=9 KLF4ΔRGDS。不另说明。=不显著**P（P）< 0.001, ***P（P）<0.0001，学生的t吨-测试。中心线表示中值，顶线和底线表示25第个和75第个百分位数。
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