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.2017年12月6日;25(12):2676-2688.
doi:10.1016/j.ymthe.2017.08.009。 Epub 2017年8月19日。

MicroRNA-218-5p作为治疗人类骨关节炎的潜在靶点

附属公司

MicroRNA-218-5p作为治疗人类骨关节炎的潜在靶点

陆军等。 分子治疗. .

摘要

新的证据表明,失调的microRNA(miRNAs)在骨关节炎(OA)中起着关键作用,但具体的microRNAs的作用尚不清楚。因此,我们确定了OA相关的miRNAs和结果的功能验证。在此,我们证明miR-218-5p在中度和重度OA中显著上调,并与改良的Mankin量表评分相关。通过功能获得和功能丧失研究表明,miR-218-5p显著影响基质合成基因的表达以及软骨细胞的增殖和凋亡。利用SW1353和C28/I2细胞,PIK3C2A mRNA被鉴定为miR-218-5p的靶点。miR-218-5p的下调显著促进了PIK3C2A及其下游靶蛋白的表达,如Akt、mTOR、S6和4EBP1。更重要的是,与对照组小鼠相比,暴露于miR-218-5p抑制剂的OA小鼠可防止软骨降解,并减少了蛋白多糖损失和关节软骨细胞细胞的损失。miR-218-5p是一种通过调节PI3K/Akt/mTOR信号来诱导软骨破坏的新型诱导剂。抑制内源性miR-218-5p的表达/活性似乎是治疗OA的一种有吸引力的方法。

关键词:PI3K/Akt/mTOR信号通路;微RNA;骨关节炎。

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数字

图1
图1
OA软骨组织中差异表达miRNA的鉴定(A)用平均连锁和非中心相关进行的层次聚类显示OA和NC之间的miRNA表达谱是不同的。相对于平均强度值,红色表示较高,绿色表示较低的表达(黑色)所有样本(配对t检验)。(B) 火山图说明了OA和NC之间差异miRNA表达的生物学和统计意义。图中的红点表示差异表达的miRNA,具有统计意义(≥2倍或≤0.5倍,Benjamini-Hochberg校正P)。(C) 与对照组相比,中度(22)和重度(58)OA患者miR-218-5p表达水平较高***p<0.001,先进行单因素方差分析,然后进行事后SNK检验。(D–F)ISH分析对照组(D)、中度OA(E)和重度OA(F)的miR-218-5p表达模式(标尺,50μm)。软骨取自中间区域。(G) miR-218-5p表达水平与Mankin量表呈正相关(r=0.746,p<0.001)。NC,正常控制。
图2
图2
经Cy5-寡核苷酸证实,miR-218-5p(A)miR-215-5p转染原代软骨细胞的体外研究。(B) 将50 nM miR-control、miR-218-5p模拟物或抑制剂转染到原代人类软骨细胞中。转染48小时后,将细胞用于以下实验。使用qRT-PCR分析miR-218-5p的转染效率(n=6个重复/组)***p<0.001,先进行单因素方差分析测试,然后进行Tukey多重比较后测试。(C) 分别在24、48、72和96小时(每组3次重复),在miR-218-5p模拟物或抑制剂转染的原代人类软骨细胞中研究软骨细胞增殖***双向方差分析检验p<0.001。(D–F)分析空白(D)、miR-218-5p抑制剂(E)或模拟(F)转染的初级人类软骨细胞的软骨细胞凋亡(每组3个重复)。(G) western blot检测Col II、aggrecan、MMP13和ADAMTS-5的表达。(H) 使用激光扫描共聚焦显微镜在100个目标下评估转染软骨细胞的II型胶原表达。
图3
图3
miR-218-5p(A)的体内研究与SS组相比,OA组在术后8周显示出较高水平的miR-215-5p(每组15个)***经Student非配对t检验,p<0.001。(B) 建立OA模型。qRT-PCR分析经关节内注射LV-miR-对照或LV-miR218-5p抑制剂治疗的OA模型软骨组织中COL2A1、ACAN、MMP13和ADAMTS-5的mRNA表达。OA组,关节内注射生理盐水治疗;OA+miR-对照组,采用关节内递送LV-mi-R治疗;OA+miR-218-5p抑制剂组,采用LV-miR-218-5抑制剂关节内给药治疗。与OA和OA+miR对照组相比,OA+miR-218-5p抑制剂组术后8周COL2A1和ACAN水平升高,MMP13和ADAMTS-5水平降低(每组15例)。OA和OA+miR对照组MMP13和ADAMTS-5水平较高,COL2A1和ACAN水平较低***经事后SNK测试,p<0.001。(C) 为了研究miR-218-5p是否能渗透到软骨中,在注射GFP标记的LV(慢病毒)-miR-218-5抑制剂和LV-Scr(爬行病毒)后,检查小鼠膝盖的切片。软骨和滑膜中观察到GFP,表明miR-218-5p可以穿透滑膜和软骨。miR-218-5p的表达可以渗透到整个软骨层。比例尺,50μm。(D) 术后5周和8周,取软骨组织进行分析。藏红花苷O-固绿染色切片显示,接受miR-218-5p抑制剂治疗的小鼠在OA后5周和8周表现出显著的OA保护作用,与减少软骨降解/纤维性颤动、蛋白聚糖损失和关节软骨细胞细胞损失有关。比例尺,400μm(顶部);100μm(底部)。(E) 关节软骨细胞的定量***经事后SNK测试,p<0.001。(F) 与OA、OA+miR对照组和OA+miR-218-5p模拟组(5周,n=6/组;8周,n=6/组)相比,OA+miR218-5p抑制剂组的胫骨内侧平台和股骨内侧软骨OARSI评分均显著降低***经事后SNK测试,p<0.001。
图4
图4
PIK3C2A作为miR-218-5p靶标的鉴定(a)Venn图显示了通过不同算法计算预测的靶向PIK3C2A的miR-218-5p。(B) PIK3C2A mRNA 3′UTR内推测的miR-218-5p结合位点的序列比对显示出与miR-215-5p高度的序列保守性和互补性。(C) 将野生型或突变型PIK3C2A 3′UTR报告质粒与miR-control、miR-218-5p模拟物、抑制剂control或miR-215-5p抑制剂共同转染到人OA软骨细胞、SW1353细胞和C28/I2细胞中。转染48小时后,检测荧光素酶活性(n=3个重复/组)***p<0.001通过单向方差分析测试,然后进行Tukey的事后分析。(D和E)在转染miR-control、miR-218-5p模拟物、抑制剂对照或miR-215-5p抑制剂的SW1353细胞(D)和C28/I2细胞(E)中,检测PIK3C2A表达水平(每组6个重复)。(F和G)***p<0.001,通过单向方差分析测试,然后进行Tukey的事后分析,这通过使用SW1353(F)和C28/I2细胞(G)的western blot进行确认。(H) 为了证实miR-218-5p模拟物在Col II和Aggrecan中诱导的抑制是由于SW1353细胞中PIK3C2A水平降低所致,我们通过瞬时转染SW1353中编码人类PIK3C2A cDNA的载体进行了拯救实验,该载体稳定表达miR-215-5p-GFP。SW1353细胞中miR-218-5p过度表达下调PIK3C2A,进而抑制Col II和Aggrecan的表达。此外,通过部分恢复PIK3C2A表达,这些miR-218-5p抑制的Col II和Aggrecan表达得以挽救。CDS,编码序列;Poly(A),Poly A尾巴。
图5
图5
miR-218-5p对PI3K/Akt/mTOR信号通路(A)SW1353细胞的调制用miR-215-5p模拟物、miR-218.5p抑制剂、其阴性对照、对照siRNA或PIK3C2A siRNA转染72小时,然后用western blotting分析测定Akt、p-Akt,mTOR、p-mTOR,S6,p-S6,4EBP1和p-4EBP1。(B) miR-218-5p调控推测机制的示意图模型。
图6
图6
临床样本中PI3K/Akt/mTOR信号通路的表达(A)PIK3C2A、Akt、mTOR、S6和4EBP1的表达水平通过qRT-PCR检测(n=18/组)(***p<0.001通过Mann-Whitney U检验),并通过免疫染色进一步验证。(B) 使用100个物镜获得图像(软骨的中间区域)。(C和D)PIK3C2A表达水平与miR-218-5p水平(r=-0.919,p<0.0001)(C)和改良Mankin量表(r=−0.809,p<000001)(D)呈负相关。

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